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熒光染料
Release Time：2022-09-21熒光顯微鏡的一個基本原理是在熒光劑的幫助下對細胞成分進行高度特異性的可視化。這可以是一種熒光蛋白——例如 GFP——在基因上與感興趣的蛋白質相關聯。如果克隆是不可能的——例如在組織學樣本中——使用免疫熒光染色等技術來可視化感興趣的蛋白質。為此，使用了與不同熒光染料連接并直接或間接與適當目標結構結合的抗體。在熒光染料的幫助下，熒光顯微鏡不僅限于蛋白質，還可用于檢測核酸、聚糖和其他結構。甚至可以使用特定應用的各種活細胞染料，這些染料允許使用細胞器選擇性染色（例如 ER、線粒體、高爾基體）或功能測定（例如，例如活細胞追蹤、標記、細胞增殖或活死細胞測定，其中熒光是讀出方式。甚至可以檢測到鈣離子等非生物物質。本文介紹了常用的熒光劑。
免疫熒光
在熒光顯微鏡中，有兩種方法可以顯示您感興趣的蛋白質。要么借助內在熒光信號——通過將熒光蛋白與靶蛋白進行基因連接——要么借助與目標蛋白特異性結合的熒光標記抗體。對于一些生物學問題，執(zhí)行后一個問題更有用甚至是必要的。例如，在組織學樣本的情況下，不可能使用熒光蛋白，因為通常樣本來自不含有任何熒光蛋白的生物體。此外，如果有功能性抗體可用，免疫熒光比熒光蛋白技術快得多，在熒光蛋白技術中，您必須克隆感興趣的基因并將 DNA 轉染到足夠的細胞中。熒光蛋白的另一個缺點在于它們本身就是蛋白質的性質。有了它，它們在細胞內具有特定的蛋白質特征，這可能導致功能障礙或對所附著的感興趣蛋白質的誤解。然而，應該考慮使用熒光蛋白通常是研究活細胞的首選方法。
免疫熒光利用抗體對其抗原的非常特異性的結合親和力。這可以有兩種不同的外觀。最簡單的方法是使用一種與感興趣的蛋白質結合的熒光標記抗體。這稱為直接免疫熒光。
在大多數情況下，使用兩種形式的抗體。第一個與目標蛋白結合，本身沒有熒光標記（一抗）。但是與一抗結合的第二種抗體（二抗）特異性地攜帶熒光染料。這種方法稱為間接免疫熒光，具有幾個優(yōu)點。一方面存在放大效應，因為不止一種二抗與一種一抗結合。另一方面，通常比用普通熒光染料標記的特異性一抗更容易找到二抗。下面，我們回顧一下最常用的熒光染料。
FITC 和 TRITC
異硫氰酸熒光素 (FITC) 是一種有機熒光染料，可能是免疫熒光和流式細胞術中最常用的染料之一。 它在 495/517 nm 處有一個激發(fā)/發(fā)射峰，并且可以借助其與蛋白質上的氨基、巰基、咪唑基、酪氨?；螋驶Y合的反應性異硫氰酸酯基團與不同的抗體偶聯。 FITC（是最早用于熒光顯微術的染料之一，也是 Alexa Fluor®488 等其他熒光染料的前體。它的熒光活性是由于其大的共軛芳族電子系統(tǒng)，可被藍色光激發(fā) 光譜。
1.果蠅胚胎發(fā)育，綠色：FITC，紅色：TRITC。
一種經常與 FITC 結合使用的染料是 TRITC（四甲基羅丹明-5-（和 6）-異硫氰酸酯）。 與 FITC 不同，TRITC 不是熒光素，而是羅丹明家族的衍生物。 羅丹明也有一個大的共軛芳香電子系統(tǒng)，這導致了它們的熒光行為。 TRITC 被綠色光譜中的光激發(fā)，最大波長為 550 nm。 其發(fā)射最大值位于 573 nm。 與蛋白質（例如抗體）的結合也基于反應性異硫氰酸酯基團。
盡管 FITC 和 TRITC 仍被廣泛使用，但它們是相當弱的熒光染料，不推薦用于最先進的顯微鏡檢查。
花青染料
Alexa Fluor® 染料是一大類帶負電荷的親水性熒光染料，常用于熒光顯微術。 所有 Alexa Fluor® 染料都是不同堿性熒光物質的磺化形式，如熒光素、香豆素、花青或羅丹明（例如 Alexa Fluor®546、Alexa Fluor®633）。 在它們的標簽中提到了各自的激光激發(fā)波長。 例如，最常用的染料之一 Alexa Fluor®488 的最大激發(fā)波長為 493 nm，允許使用標準 488 nm 激光進行激發(fā)，而 Alexa Fluor®488 的最大發(fā)射波長為 519 nm，它是一種熒光素衍生物和 具有與 FITC 相似的特性。 然而，它顯示出更好的穩(wěn)定性、亮度和更低的 pH 敏感性。
2. 小鼠轉基因胚胎，中間體，E10.5小鼠轉基因胚胎的五個中間體：EpaxisMyf5 eGFP； 對 GFP-Alexa 488 進行免疫染色； 胚胎肌纖維用 Desmin-Cy3 染色，細胞核從上到下顯示為 Hoechst 尺寸：3.5 mm (a), 800 µm (b)。 禮貌：Aurélie Jory, Cellules Souches et Développement, Institut Pasteur, Paris, France 和 IGBMC, IGBMC 影像中心
3.小鼠成纖維細胞，綠色：F-Actin，FITC，紅色：Tubulin，Cy5，藍色：Nuclei，DAPI。
DNA染色
您可能想使用熒光顯微鏡研究核酸。例如，通過檢測細胞核來定義細胞的確切位置或數量。最常見的 DNA 染色劑之一是 DAPI（4',6-diamidino-2-phenylindole），它與 DNA 雙螺旋的富含 A-T 的區(qū)域結合。與未結合狀態(tài)相比，如果連接到 DNA 上，DAPI 熒光強度會增加。它被最大波長為 358 nm 的紫外光激發(fā)。發(fā)射光譜很寬，峰值在 461 nm。對于 RNA 結合，也可以檢測到微弱的熒光。在這種情況下，發(fā)射移至 500 nm。有趣的是，DAPI 能夠滲透完整的質膜，使其對固定細胞和活細胞有用。
第二種廣泛使用的 DNA 染色選項是 Hoechst 染料系列。 Hoechst 33258、Hoechst 33342 和 Hoechst 34580 是具有向 A-T 富集區(qū)域插入趨勢的雙苯并亞胺。與 DAPI 類似，它們被紫外光激發(fā)并在 455 nm 處具有最大發(fā)射，在未結合條件下移動到 510–540 nm。 Hoechst 染料還具有細胞滲透性，因此可用于固定細胞和活細胞。它們的毒性低于 DAPI。
不透膜的 DNA 染色劑是碘化丙啶，通常用于區(qū)分細胞培養(yǎng)物中的活細胞和死細胞，因為它不能進入??完整細胞。碘化丙啶也是一種嵌入劑，但對不同的堿基沒有結合偏好。在核酸結合狀態(tài)下，其最大激發(fā)波長為 538 nm。最高發(fā)射波長為 617 nm。未結合的碘化丙啶激發(fā)和發(fā)射最大值移動到較低的波長和較低的強度。它還可以在不改變其熒光特性的情況下與 RNA 結合。為了區(qū)分 DNA 和 RNA，有必要使用足夠的核酸酶。
一種無需事先操作即可在 DNA 和 RNA 之間產生差異的染料是吖啶橙。它的最大激發(fā)/發(fā)射對在 DNA 結合狀態(tài)下為 502 nm/525 nm，在 RNA 結合狀態(tài)下變?yōu)?460 nm/650 nm。此外，它可以進入酸性區(qū)室，如陽離子染料質子化的溶酶體。在這種酸性環(huán)境中，吖啶橙被藍色光譜中的光激發(fā)，而橙色區(qū)域的發(fā)射最強。它通常用于識別凋亡細胞，因為它們有很多被吞噬的酸性隔間
區(qū)室和細胞器特異性染料
有許多特定的染料可用于研究細胞區(qū)室，例如溶酶體、內體或細胞器，例如線粒體。
一種眾所周知的觀察線粒體的方法是使用 MitoTracker®。這是一種細胞滲透性染料，具有溫和的硫醇反應性氯甲基部分，用于通過與半胱氨酸殘基的游離硫醇基團反應共價結合基質蛋白。 MitoTracker® 以不同的顏色和修飾形式存在（見表 1）。與羅丹明 123 或四甲基玫瑰胺等常規(guī)線粒體特異性染色劑相比，MitoTracker® 在用固定劑破壞膜電位后不會被洗掉。
LysoTracker 是一組不同顏色的染料，用于染色溶酶體等酸性隔室。這些是與熒光團連接的可滲透膜的弱堿基。由于質子化，這些堿很可能對酸性區(qū)室具有親和力（見表 1）。
與溶酶體相當的隔室是釀酒酵母等真菌中的液泡。這種膜封閉空間也是酸性的。在熒光顯微鏡中觀察它的一種方法是使用苯乙烯基染料，如 FM 4-64® 或 FM 5-95®。
在研究蛋白質分泌時，內質網 (ER) 通常會被染色。一種經典的染色該隔室的染料是 DiOC6(3)，它對 ER 有偏好，但仍與線粒體等其他膜結合。另一種專門染色 ER 的方法是使用 ER-Tracker，例如 ER-Tracker Green 和 ER-Tracker Red。兩者都是基于 BODIPY 的染料，它們與格列本脲（一種磺酰脲酶）相連，它與僅駐留在 ER 膜中的 ATP 敏感鉀通道結合。 BODIPY（硼-二吡咯亞甲基）描述了一組幾乎不溶于水的相對 pH 不敏感的染料。這使它們成為脂質和膜標記的非常好的工具。
4. 浦肯野細胞，小鼠小腦皮質的三重標記旁矢狀切面。 紅色：抗鈣結合蛋白-D28k/Cy3，綠色：抗 GFAP/Cy5，藍色：Hoechst 33258。
與 ER 相鄰的隔間 - 高爾基體 - 可以用熒光神經酰胺類似物標記，如 NBD C6-神經酰胺和 BODIPY FL C5-神經酰胺。 神經酰胺是高爾基體中高度富集的鞘脂。
借助其他基于脂質的染料，可以對特殊的膜區(qū)域（如脂質筏）進行染色。 這些富含膽固醇的結構域可以通過使用 NBD-6 膽固醇或 NBP-12 膽固醇等（Avanti Polar Lipids）來可視化。
還可以借助對細胞中不同位置的偏好的蛋白質對感興趣的區(qū)域進行染色。 一個例子是使用小麥胚芽凝集素 (WGA)，它與質膜中存在的唾液酸和 N-乙酰氨基葡糖特異性結合。
離子成像
在神經元研究、基因活動或細胞運動的情況下，研究細胞的離子濃度是有意義的。鈉、鈣、氯或鎂離子對許多不同的細胞事件有深遠的影響。通常，離子可以在熒光標記的螯合劑的幫助下被捕獲，這些螯合劑在與適當的離子結合時會改變它們的光譜特性。標記螯合劑的一個例子是鈣指示劑 fura-2、indo-1、fluo-3、fluo-4 和 Calcium-Green。對于鈉檢測，通常使用 SBFI（鈉結合苯并呋喃間苯二甲酸酯）或鈉綠。 PBFI（鉀結合苯并呋喃間苯二甲酸酯）檢測鉀離子。
功能分析
“功能測定”是一個廣義術語，用于涵蓋標準化實驗，以評估可以用熒光標記物可視化的各種功能。這些標記可以包括但不限于任何上述標記技術和熒光團。對于許多這些功能性分析，染色試劑盒是市售的，可以很容易地應用于各種各樣的樣品。功能測定的一個例子是眾所周知的和廣泛使用的活死測定。兩個熒光團用于標記活細胞和死細胞。掌握這兩個值，就可以評估細胞的整體健康狀況。將此信息與其他標記相關聯甚至可以增加對基本過程的理解。
熒光染料及其激發(fā)和發(fā)射波長
下表顯示了熒光染料的完整列表及其各自的激發(fā)和發(fā)射波長峰值。請注意，除了這些峰之外，每種染料都具有不同的激發(fā)和發(fā)射光譜。在一個實驗中選擇幾種染料組合使用時，研究人員應注意由于串擾（或滲漏）導致的重疊激發(fā)和發(fā)射光譜，這可能導致假陰性或陽性，或以其他方式模糊數據。另一個可以扭曲熒光成像的來源是細胞和組織中天然存在的熒光蛋白產生的自發(fā)熒光，這在植物或藻類的實驗中尤其需要考慮。充分了解樣品中所用染料的光譜對于選擇合適的激發(fā)光源（例如 LED、弧光燈、激光線）以及合適的發(fā)??射濾光片和檢測器也很重要。
6.Alexa 488（綠色曲線）和Alexa 555（黃色曲線）的熒光發(fā)射曲線。 兩個發(fā)射光譜的重疊是顯而易見的。 紅線表示 488 發(fā)射濾波器的帶通。
表1-熒光染料
免疫熒光
在熒光顯微鏡中，有兩種方法可以顯示您感興趣的蛋白質。要么借助內在熒光信號——通過將熒光蛋白與靶蛋白進行基因連接——要么借助與目標蛋白特異性結合的熒光標記抗體。對于一些生物學問題，執(zhí)行后一個問題更有用甚至是必要的。例如，在組織學樣本的情況下，不可能使用熒光蛋白，因為通常樣本來自不含有任何熒光蛋白的生物體。此外，如果有功能性抗體可用，免疫熒光比熒光蛋白技術快得多，在熒光蛋白技術中，您必須克隆感興趣的基因并將 DNA 轉染到足夠的細胞中。熒光蛋白的另一個缺點在于它們本身就是蛋白質的性質。有了它，它們在細胞內具有特定的蛋白質特征，這可能導致功能障礙或對所附著的感興趣蛋白質的誤解。然而，應該考慮使用熒光蛋白通常是研究活細胞的首選方法。
免疫熒光利用抗體對其抗原的非常特異性的結合親和力。這可以有兩種不同的外觀。最簡單的方法是使用一種與感興趣的蛋白質結合的熒光標記抗體。這稱為直接免疫熒光。
在大多數情況下，使用兩種形式的抗體。第一個與目標蛋白結合，本身沒有熒光標記（一抗）。但是與一抗結合的第二種抗體（二抗）特異性地攜帶熒光染料。這種方法稱為間接免疫熒光，具有幾個優(yōu)點。一方面存在放大效應，因為不止一種二抗與一種一抗結合。另一方面，通常比用普通熒光染料標記的特異性一抗更容易找到二抗。下面，我們回顧一下最常用的熒光染料。
FITC 和 TRITC
異硫氰酸熒光素 (FITC) 是一種有機熒光染料，可能是免疫熒光和流式細胞術中最常用的染料之一。 它在 495/517 nm 處有一個激發(fā)/發(fā)射峰，并且可以借助其與蛋白質上的氨基、巰基、咪唑基、酪氨?；螋驶Y合的反應性異硫氰酸酯基團與不同的抗體偶聯。 FITC（是最早用于熒光顯微術的染料之一，也是 Alexa Fluor®488 等其他熒光染料的前體。它的熒光活性是由于其大的共軛芳族電子系統(tǒng)，可被藍色光激發(fā) 光譜。
1.果蠅胚胎發(fā)育，綠色：FITC，紅色：TRITC。
一種經常與 FITC 結合使用的染料是 TRITC（四甲基羅丹明-5-（和 6）-異硫氰酸酯）。 與 FITC 不同，TRITC 不是熒光素，而是羅丹明家族的衍生物。 羅丹明也有一個大的共軛芳香電子系統(tǒng)，這導致了它們的熒光行為。 TRITC 被綠色光譜中的光激發(fā)，最大波長為 550 nm。 其發(fā)射最大值位于 573 nm。 與蛋白質（例如抗體）的結合也基于反應性異硫氰酸酯基團。
盡管 FITC 和 TRITC 仍被廣泛使用，但它們是相當弱的熒光染料，不推薦用于最先進的顯微鏡檢查。
花青染料
Alexa Fluor® 染料是一大類帶負電荷的親水性熒光染料，常用于熒光顯微術。 所有 Alexa Fluor® 染料都是不同堿性熒光物質的磺化形式，如熒光素、香豆素、花青或羅丹明（例如 Alexa Fluor®546、Alexa Fluor®633）。 在它們的標簽中提到了各自的激光激發(fā)波長。 例如，最常用的染料之一 Alexa Fluor®488 的最大激發(fā)波長為 493 nm，允許使用標準 488 nm 激光進行激發(fā)，而 Alexa Fluor®488 的最大發(fā)射波長為 519 nm，它是一種熒光素衍生物和 具有與 FITC 相似的特性。 然而，它顯示出更好的穩(wěn)定性、亮度和更低的 pH 敏感性。
2. 小鼠轉基因胚胎，中間體，E10.5小鼠轉基因胚胎的五個中間體：EpaxisMyf5 eGFP； 對 GFP-Alexa 488 進行免疫染色； 胚胎肌纖維用 Desmin-Cy3 染色，細胞核從上到下顯示為 Hoechst 尺寸：3.5 mm (a), 800 µm (b)。 禮貌：Aurélie Jory, Cellules Souches et Développement, Institut Pasteur, Paris, France 和 IGBMC, IGBMC 影像中心
3.小鼠成纖維細胞，綠色：F-Actin，FITC，紅色：Tubulin，Cy5，藍色：Nuclei，DAPI。
DNA染色
您可能想使用熒光顯微鏡研究核酸。例如，通過檢測細胞核來定義細胞的確切位置或數量。最常見的 DNA 染色劑之一是 DAPI（4',6-diamidino-2-phenylindole），它與 DNA 雙螺旋的富含 A-T 的區(qū)域結合。與未結合狀態(tài)相比，如果連接到 DNA 上，DAPI 熒光強度會增加。它被最大波長為 358 nm 的紫外光激發(fā)。發(fā)射光譜很寬，峰值在 461 nm。對于 RNA 結合，也可以檢測到微弱的熒光。在這種情況下，發(fā)射移至 500 nm。有趣的是，DAPI 能夠滲透完整的質膜，使其對固定細胞和活細胞有用。
第二種廣泛使用的 DNA 染色選項是 Hoechst 染料系列。 Hoechst 33258、Hoechst 33342 和 Hoechst 34580 是具有向 A-T 富集區(qū)域插入趨勢的雙苯并亞胺。與 DAPI 類似，它們被紫外光激發(fā)并在 455 nm 處具有最大發(fā)射，在未結合條件下移動到 510–540 nm。 Hoechst 染料還具有細胞滲透性，因此可用于固定細胞和活細胞。它們的毒性低于 DAPI。
不透膜的 DNA 染色劑是碘化丙啶，通常用于區(qū)分細胞培養(yǎng)物中的活細胞和死細胞，因為它不能進入??完整細胞。碘化丙啶也是一種嵌入劑，但對不同的堿基沒有結合偏好。在核酸結合狀態(tài)下，其最大激發(fā)波長為 538 nm。最高發(fā)射波長為 617 nm。未結合的碘化丙啶激發(fā)和發(fā)射最大值移動到較低的波長和較低的強度。它還可以在不改變其熒光特性的情況下與 RNA 結合。為了區(qū)分 DNA 和 RNA，有必要使用足夠的核酸酶。
一種無需事先操作即可在 DNA 和 RNA 之間產生差異的染料是吖啶橙。它的最大激發(fā)/發(fā)射對在 DNA 結合狀態(tài)下為 502 nm/525 nm，在 RNA 結合狀態(tài)下變?yōu)?460 nm/650 nm。此外，它可以進入酸性區(qū)室，如陽離子染料質子化的溶酶體。在這種酸性環(huán)境中，吖啶橙被藍色光譜中的光激發(fā)，而橙色區(qū)域的發(fā)射最強。它通常用于識別凋亡細胞，因為它們有很多被吞噬的酸性隔間
區(qū)室和細胞器特異性染料
有許多特定的染料可用于研究細胞區(qū)室，例如溶酶體、內體或細胞器，例如線粒體。
一種眾所周知的觀察線粒體的方法是使用 MitoTracker®。這是一種細胞滲透性染料，具有溫和的硫醇反應性氯甲基部分，用于通過與半胱氨酸殘基的游離硫醇基團反應共價結合基質蛋白。 MitoTracker® 以不同的顏色和修飾形式存在（見表 1）。與羅丹明 123 或四甲基玫瑰胺等常規(guī)線粒體特異性染色劑相比，MitoTracker® 在用固定劑破壞膜電位后不會被洗掉。
LysoTracker 是一組不同顏色的染料，用于染色溶酶體等酸性隔室。這些是與熒光團連接的可滲透膜的弱堿基。由于質子化，這些堿很可能對酸性區(qū)室具有親和力（見表 1）。
與溶酶體相當的隔室是釀酒酵母等真菌中的液泡。這種膜封閉空間也是酸性的。在熒光顯微鏡中觀察它的一種方法是使用苯乙烯基染料，如 FM 4-64® 或 FM 5-95®。
在研究蛋白質分泌時，內質網 (ER) 通常會被染色。一種經典的染色該隔室的染料是 DiOC6(3)，它對 ER 有偏好，但仍與線粒體等其他膜結合。另一種專門染色 ER 的方法是使用 ER-Tracker，例如 ER-Tracker Green 和 ER-Tracker Red。兩者都是基于 BODIPY 的染料，它們與格列本脲（一種磺酰脲酶）相連，它與僅駐留在 ER 膜中的 ATP 敏感鉀通道結合。 BODIPY（硼-二吡咯亞甲基）描述了一組幾乎不溶于水的相對 pH 不敏感的染料。這使它們成為脂質和膜標記的非常好的工具。
4. 浦肯野細胞，小鼠小腦皮質的三重標記旁矢狀切面。 紅色：抗鈣結合蛋白-D28k/Cy3，綠色：抗 GFAP/Cy5，藍色：Hoechst 33258。
與 ER 相鄰的隔間 - 高爾基體 - 可以用熒光神經酰胺類似物標記，如 NBD C6-神經酰胺和 BODIPY FL C5-神經酰胺。 神經酰胺是高爾基體中高度富集的鞘脂。
借助其他基于脂質的染料，可以對特殊的膜區(qū)域（如脂質筏）進行染色。 這些富含膽固醇的結構域可以通過使用 NBD-6 膽固醇或 NBP-12 膽固醇等（Avanti Polar Lipids）來可視化。
還可以借助對細胞中不同位置的偏好的蛋白質對感興趣的區(qū)域進行染色。 一個例子是使用小麥胚芽凝集素 (WGA)，它與質膜中存在的唾液酸和 N-乙酰氨基葡糖特異性結合。
離子成像
在神經元研究、基因活動或細胞運動的情況下，研究細胞的離子濃度是有意義的。鈉、鈣、氯或鎂離子對許多不同的細胞事件有深遠的影響。通常，離子可以在熒光標記的螯合劑的幫助下被捕獲，這些螯合劑在與適當的離子結合時會改變它們的光譜特性。標記螯合劑的一個例子是鈣指示劑 fura-2、indo-1、fluo-3、fluo-4 和 Calcium-Green。對于鈉檢測，通常使用 SBFI（鈉結合苯并呋喃間苯二甲酸酯）或鈉綠。 PBFI（鉀結合苯并呋喃間苯二甲酸酯）檢測鉀離子。
功能分析
“功能測定”是一個廣義術語，用于涵蓋標準化實驗，以評估可以用熒光標記物可視化的各種功能。這些標記可以包括但不限于任何上述標記技術和熒光團。對于許多這些功能性分析，染色試劑盒是市售的，可以很容易地應用于各種各樣的樣品。功能測定的一個例子是眾所周知的和廣泛使用的活死測定。兩個熒光團用于標記活細胞和死細胞。掌握這兩個值，就可以評估細胞的整體健康狀況。將此信息與其他標記相關聯甚至可以增加對基本過程的理解。
熒光染料及其激發(fā)和發(fā)射波長
下表顯示了熒光染料的完整列表及其各自的激發(fā)和發(fā)射波長峰值。請注意，除了這些峰之外，每種染料都具有不同的激發(fā)和發(fā)射光譜。在一個實驗中選擇幾種染料組合使用時，研究人員應注意由于串擾（或滲漏）導致的重疊激發(fā)和發(fā)射光譜，這可能導致假陰性或陽性，或以其他方式模糊數據。另一個可以扭曲熒光成像的來源是細胞和組織中天然存在的熒光蛋白產生的自發(fā)熒光，這在植物或藻類的實驗中尤其需要考慮。充分了解樣品中所用染料的光譜對于選擇合適的激發(fā)光源（例如 LED、弧光燈、激光線）以及合適的發(fā)??射濾光片和檢測器也很重要。
6.Alexa 488（綠色曲線）和Alexa 555（黃色曲線）的熒光發(fā)射曲線。 兩個發(fā)射光譜的重疊是顯而易見的。 紅線表示 488 發(fā)射濾波器的帶通。
表1-熒光染料
| 熒光染料產品 | Excitation | Emission |
| Indo-1, Ca saturated | 331 nm | 404 nm |
| Indo-1 Ca2+ | 346 nm | 404 nm |
| Cascade Blue BSA pH 7.0 | 401 nm | 419 nm |
| Cascade Blue | 398 nm | 420 nm |
| LysoTracker Blue | 373 nm | 421 nm |
| Alexa 405 | 401 nm | 421 nm |
| LysoSensor Blue pH 5.0 | 374 nm | 424 nm |
| LysoSensor Blue | 374 nm | 424 nm |
| DyLight 405 | 399 nm | 434 nm |
| DyLight 350 | 332 nm | 435 nm |
| BFP (Blue Fluorescent Protein) | 380 nm | 439 nm |
| Alexa 350 | 343 nm | 441 nm |
| 7-Amino-4-methylcoumarin pH 7.0 | 346 nm | 442 nm |
| Amino Coumarin | 345 nm | 442 nm |
| AMCA conjugate | 347 nm | 444 nm |
| Coumarin | 360 nm | 447 nm |
| 7-Hydroxy-4-methylcoumarin | 360 nm | 447 nm |
| 7-Hydroxy-4-methylcoumarin pH 9.0 | 361 nm | 448 nm |
| 6,8-Difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin pH 9.0 | 358 nm | 450 nm |
| Hoechst 33342 | 352 nm | 455 nm |
| Pacific Blue | 404 nm | 455 nm |
| Hoechst 33258 | 352 nm | 455 nm |
| Hoechst 33258-DNA | 352 nm | 455 nm |
| Pacific Blue antibody conjugate pH 8.0 | 404 nm | 455 nm |
| PO-PRO-1 | 434 nm | 457 nm |
| PO-PRO-1-DNA | 435 nm | 457 nm |
| POPO-1 | 433 nm | 457 nm |
| POPO-1-DNA | 433 nm | 458 nm |
| DAPI-DNA | 359 nm | 461 nm |
| DAPI | 358 nm | 463 nm |
| Marina Blue | 362 nm | 464 nm |
| SYTOX Blue-DNA | 445 nm | 470 nm |
| CFP (Cyan Fluorescent Protein) | 434 nm | 474 nm |
| eCFP (Enhanced Cyan Fluorescent Protein) | 437 nm | 476 nm |
| 1-Anilinonaphthalene-8-sulfonic acid (1,8-ANS) | 375 nm | 479 nm |
| Indo-1, Ca free | 346 nm | 479 nm |
| 1,8-ANS (1-Anilinonaphthalene-8-sulfonic acid) | 375 nm | 480 nm |
| BO-PRO-1-DNA | 462 nm | 482 nm |
| BOPRO-1 | 462 nm | 482 nm |
| BOBO-1-DNA | 461 nm | 484 nm |
| SYTO 45-DNA | 451 nm | 486 nm |
| evoglow-Pp1 | 448 nm | 495 nm |
| evoglow-Bs1 | 448 nm | 496 nm |
| evoglow-Bs2 | 448 nm | 496 nm |
| Auramine O | 431 nm | 501 nm |
| DiO | 487 nm | 501 nm |
| LysoSensor Green pH 5.0 | 447 nm | 502 nm |
| Cy 2 | 489 nm | 503 nm |
| LysoSensor Green | 447 nm | 504 nm |
| Fura-2, high Ca | 336 nm | 504 nm |
| Fura-2 Ca2+sup> | 336 nm | 505 nm |
| SYTO 13-DNA | 488 nm | 506 nm |
| YO-PRO-1-DNA | 491 nm | 507 nm |
| YOYO-1-DNA | 491 nm | 509 nm |
| eGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) | 488 nm | 509 nm |
| LysoTracker Green | 503 nm | 509 nm |
| GFP聽(S65T) | 489 nm | 509 nm |
| BODIPY FL, MeOH | 502 nm | 511 nm |
| Sapphire | 396 nm | 511 nm |
| BODIPY FL conjugate | 503 nm | 512 nm |
| MitoTracker Green | 490 nm | 512 nm |
| MitoTracker Green FM, MeOH | 490 nm | 512 nm |
| Fluorescein 0.1 M NaOH | 493 nm | 513 nm |
| Calcein pH 9.0 | 494 nm | 514 nm |
| Fluorescein pH 9.0 | 490 nm | 514 nm |
| Calcein | 493 nm | 514 nm |
| Fura-2, no Ca | 367 nm | 515 nm |
| Fluo-4 | 494 nm | 516 nm |
| FDA | 495 nm | 517 nm |
| DTAF | 495 nm | 517 nm |
| Fluorescein | 495 nm | 517 nm |
| Fluorescein antibody conjugate pH 8.0 | 493 nm | 517 nm |
| CFDA | 495 nm | 517 nm |
| FITC | 495 nm | 517 nm |
| Alexa Fluor 488 hydrazide-water | 493 nm | 518 nm |
| DyLight 488 | 493 nm | 518 nm |
| 5-FAM pH 9.0 | 492 nm | 518 nm |
| FITC聽antibody conjugate pH 8.0 | 495 nm | 519 nm |
| Alexa 488 | 493 nm | 520 nm |
| Rhodamine 110 | 497 nm | 520 nm |
| Rhodamine 110 pH 7.0 | 497 nm | 520 nm |
| Acridine Orange | 431 nm | 520 nm |
| Alexa Fluor 488 antibody conjugate pH 8.0 | 499 nm | 520 nm |
| BCECF pH 5.5 | 485 nm | 521 nm |
| PicoGreendsDNA quantitation reagent | 502 nm | 522 nm |
| SYBR Green I | 498 nm | 522 nm |
| Rhodaminen Green pH 7.0 | 497 nm | 523 nm |
| CyQUANT GR-DNA | 502 nm | 523 nm |
| NeuroTrace 500/525, green fluorescent Nissl stain-RNA | 497 nm | 524 nm |
| DansylCadaverine | 335 nm | 524 nm |
| Rhodol Green antibody conjugate pH 8.0 | 499 nm | 524 nm |
| Fluoro-Emerald | 495 nm | 524 nm |
| Nissl | 497 nm | 524 nm |
| Fluorescein dextran pH 8.0 | 501 nm | 524 nm |
| Rhodamine Green | 497 nm | 524 nm |
| 5-(and-6)-Carboxy-2', 7'-dichlorofluorescein pH 9.0 | 504 nm | 525 nm |
| DansylCadaverine, MeOH | 335 nm | 526 nm |
| eYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) | 514 nm | 526 nm |
| Oregon Green 488 | 498 nm | 526 nm |
| Oregon Green 488 antibody conjugate pH 8.0 | 498 nm | 526 nm |
| Fluo-3 | 506 nm | 527 nm |
| BCECF pH 9.0 | 501 nm | 527 nm |
| SBFI-Na+ | 336 nm | 527 nm |
| Fluo-3 Ca2+ | 506 nm | 527 nm |
| Rhodamine 123, MeOH | 507 nm | 529 nm |
| FlAsH | 509 nm | 529 nm |
| Calcium Green-1 Ca2+ | 506 nm | 529 nm |
| Magnesium Green | 507 nm | 530 nm |
| DM-NERF pH 4.0 | 493 nm | 530 nm |
| Calcium Green | 506 nm | 530 nm |
| Citrine | 515 nm | 530 nm |
| LysoSensor Yellow pH 9.0 | 335 nm | 530 nm |
| TO-PRO-1-DNA | 515 nm | 531 nm |
| Magnesium Green Mg2+ | 507 nm | 531 nm |
| Sodium Green Na+ | 507 nm | 531 nm |
| TOTO-1-DNA | 514 nm | 531 nm |
| Oregon Green 514 | 512 nm | 532 nm |
| Oregon Green 514 antibody conjugate pH 8.0 | 513 nm | 533 nm |
| NBD-X | 466 nm | 534 nm |
| DM-NERF pH 7.0 | 509 nm | 537 nm |
| NBD-X, MeOH | 467 nm | 538 nm |
| CI-NERF pH 6.0 | 513 nm | 538 nm |
| Alexa 430 | 431 nm | 540 nm |
| Alexa Fluor 430 antibody conjugate pH 7.2 | 431 nm | 540 nm |
| CI-NERF pH 2.5 | 504 nm | 541 nm |
| Lucifer Yellow, CH | 428 nm | 542 nm |
| LysoSensor Yellow pH 3.0 | 389 nm | 542 nm |
| 6-TET, SE pH 9.0 | 521 nm | 542 nm |
| Eosin antibody conjugate pH 8.0 | 525 nm | 546 nm |
| Eosin | 524 nm | 546 nm |
| 6-Carboxyrhodamine 6G pH 7.0 | 526 nm | 547 nm |
| 6-Carboxyrhodamine 6G, hydrochloride | 525 nm | 547 nm |
| Bodipy R6G SE | 528 nm | 547 nm |
| BODIPY R6G, MeOH | 528 nm | 547 nm |
| 6 JOE | 520 nm | 548 nm |
| Cascade Yellow antibody conjugate pH 8.0 | 399 nm | 549 nm |
| Cascade Yellow | 399 nm | 549 nm |
| mBanana | 540 nm | 553 nm |
| Alexa Fluor 532 antibody conjugate pH 7.2 | 528 nm | 553 nm |
| Alexa 532 | 528 nm | 553 nm |
| Erythrosin-5-isothiocyanate pH 9.0 | 533 nm | 554 nm |
| 6-HEX, SE pH 9.0 | 534 nm | 559 nm |
| mOrange | 548 nm | 562 nm |
| mHoneydew | 478 nm | 562 nm |
| Cy 3 | 549 nm | 562 nm |
| Rhodamine B | 543 nm | 565 nm |
| DiI | 551 nm | 565 nm |
| 5-TAMRA-MeOH | 543 nm | 567 nm |
| Alexa 555 | 553 nm | 568 nm |
| Alexa Fluor 555 antibody conjugate pH 7.2 | 553 nm | 568 nm |
| DyLight 549 | 555 nm | 569 nm |
| BODIPY TMR-X, SE | 544 nm | 570 nm |
| BODIPY TMR-X, MeOH | 544 nm | 570 nm |
| PO-PRO-3-DNA | 539 nm | 571 nm |
| PO-PRO-3 | 539 nm | 571 nm |
| Rhodamine | 551 nm | 573 nm |
| Bodipy TMR-X conjugate | 544 nm | 573 nm |
| POPO-3 | 533 nm | 573 nm |
| Alexa 546 | 562 nm | 573 nm |
| BODIPY TMR-X antibody conjugate pH 7.2 | 544 nm | 573 nm |
| Calcium Orange Ca2+ | 549 nm | 573 nm |
| TRITC | 550 nm | 573 nm |
| Calcium Orange | 549 nm | 574 nm |
| Rhodaminephalloidin pH 7.0 | 558 nm | 575 nm |
| MitoTracker Orange | 551 nm | 575 nm |
| MitoTracker Orange, MeOH | 551 nm | 575 nm |
| Phycoerythrin | 565 nm | 575 nm |
| Magnesium Orange | 550 nm | 575 nm |
| R-Phycoerythrin pH 7.5 | 565 nm | 576 nm |
| 5-TAMRA pH 7.0 | 553 nm | 576 nm |
| 5-TAMRA | 549 nm | 577 nm |
| Rhod-2 | 552 nm | 577 nm |
| FM 1-43 | 472 nm | 578 nm |
| Rhod-2 Ca2+ | 553 nm | 578 nm |
| Tetramethylrhodamine antibody conjugate pH 8.0 | 552 nm | 578 nm |
| FM 1-43 lipid | 473 nm | 579 nm |
| LOLO-1-DNA | 568 nm | 580 nm |
| dTomato | 554 nm | 581 nm |
| DsRed | 563 nm | 581 nm |
| Dapoxyl (2-aminoethyl) sulfonamide | 372 nm | 582 nm |
| Tetramethylrhodamine dextran pH 7.0 | 555 nm | 582 nm |
| Fluor-Ruby | 554 nm | 582 nm |
| Resorufin | 571 nm | 584 nm |
| Resorufin pH 9.0 | 571 nm | 584 nm |
| mTangerine | 568 nm | 585 nm |
| LysoTracker Red | 578 nm | 589 nm |
| Lissaminerhodamine | 572 nm | 590 nm |
| Cy 3.5 | 578 nm | 591 nm |
| Rhodamine Red-X antibody conjugate pH 8.0 | 573 nm | 591 nm |
| Sulforhodamine 101, EtOH | 578 nm | 593 nm |
| JC-1 pH 8.2 | 593 nm | 595 nm |
| JC-1 | 592 nm | 595 nm |
| mStrawberry | 575 nm | 596 nm |
| MitoTracker Red | 578 nm | 599 nm |
| MitoTracker Red, MeOH | 578 nm | 599 nm |
| X-Rhod-1 Ca2+ | 580 nm | 602 nm |
| Alexa Fluor 568 antibody conjugate pH 7.2 | 579 nm | 603 nm |
| Alexa 568 | 576 nm | 603 nm |
| 5-ROX pH 7.0 | 578 nm | 604 nm |
| 5-ROX (5-Carboxy-X-rhodamine, triethylammonium salt) | 578 nm | 604 nm |
| BO-PRO-3-DNA | 574 nm | 604 nm |
| BOPRO-3 | 574 nm | 604 nm |
| BOBO-3-DNA | 570 nm | 605 nm |
| Ethidium Bromide | 524 nm | 605 nm |
| ReAsH | 597 nm | 608 nm |
| Calcium Crimson | 589 nm | 608 nm |
| Calcium Crimson Ca2+ | 590 nm | 608 nm |
| mRFP | 585 nm | 608 nm |
| mCherry | 587 nm | 610 nm |
| Texas Red-X antibody conjugate pH 7.2 | 596 nm | 613 nm |
| HcRed | 590 nm | 614 nm |
| DyLight 594 | 592 nm | 616 nm |
| Ethidium homodimer-1-DNA | 528 nm | 617 nm |
| Ethidiumhomodimer | 528 nm | 617 nm |
| Propidium Iodide | 538 nm | 617 nm |
| SYPRO Ruby | 467 nm | 618 nm |
| Propidium Iodide-DNA | 538 nm | 619 nm |
| Alexa 594 | 590 nm | 619 nm |
| BODIPY TR-X, SE | 588 nm | 621 nm |
| BODIPY TR-X, MeOH | 588 nm | 621 nm |
| BODIPY TR-X phallacidin pH 7.0 | 590 nm | 621 nm |
| Alexa Fluor 610 R-phycoerythrin streptavidin pH 7.2 | 567 nm | 627 nm |
| YO-PRO-3-DNA | 613 nm | 629 nm |
| Di-8 ANEPPS | 469 nm | 630 nm |
| Di-8-ANEPPS-lipid | 469 nm | 631 nm |
| YOYO-3-DNA | 612 nm | 631 nm |
| Nile Red-lipid | 553 nm | 636 nm |
| Nile Red | 559 nm | 637 nm |
| DyLight 633 | 624 nm | 646 nm |
| mPlum | 587 nm | 649 nm |
| TO-PRO-3-DNA | 642 nm | 657 nm |
| DDAO pH 9.0 | 648 nm | 657 nm |
| Fura Red, high Ca | 434 nm | 659 nm |
| Allophycocyanin pH 7.5 | 651 nm | 660 nm |
| APC (allophycocyanin) | 650 nm | 660 nm |
| Nile Blue, EtOH | 631 nm | 660 nm |
| TOTO-3-DNA | 642 nm | 661 nm |
| Cy 5 | 646 nm | 664 nm |
| BODIPY 650/665-X, MeOH | 646 nm | 664 nm |
| Alexa Fluor 647 R-phycoerythrin streptavidin pH 7.2 | 569 nm | 666 nm |
| DyLight 649 | 652 nm | 668 nm |
| Alexa Fluor 647 antibody conjugate pH 7.2 | 653 nm | 668 nm |
| Alexa 647 | 653 nm | 669 nm |
| Fura Red Ca2+ | 435 nm | 670 nm |
| Atto 647 | 644 nm | 670 nm |
| Fura Red, low Ca | 472 nm | 673 nm |
| Carboxynaphthofluorescein pH 10.0 | 600 nm | 674 nm |
| Alexa 660 | 664 nm | 691 nm |
| Alexa Fluor 660 antibody conjugate pH 7.2 | 663 nm | 691 nm |
| Cy 5.5 | 673 nm | 692 nm |
| Alexa Fluor 680 antibody conjugate pH 7.2 | 679 nm | 702 nm |
| Alexa 680 | 679 nm | 703 nm |
| DyLight 680 | 678 nm | 706 nm |
| Alexa Fluor 700 antibody conjugate pH 7.2 | 696 nm | 719 nm |
| Alexa 700 | 696 nm | 720 nm |
| FM 4-64, 2% CHAPS | 506 nm | 751 nm |
| FM 4-64 | 508 nm | 751 nm |
