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RNA和DNA的分離和純化
Release Time：2022-09-20核酸的分離和純化對于任何分子生物學實驗都非常重要。 它是所有類型的分子生物學實驗（如限制性消化、克隆、PCR、DNA 文庫和測序）的起始材料。 通過操縱這種提取的DNA或RNA，可以獲得具有不同特征的新DNA。 基因工程過程僅依賴于 DNA、RNA 和蛋白質(zhì)。 提取 DNA 的基本過程包括從細胞中釋放 DNA，純化用于實驗的 DNA。 在整個提取過程中，所有溶液的 pH 值都保持在 pH-8.0。
DNA的分離純化主要包括四個步驟：
※ 細胞裂解;
※ 酶處理;
※ DNA/RNA的純化;
※ DNA或RNA的定量.
1. 細胞裂解
為了從細胞中釋放成分，它是必需的。治療的性質(zhì)將根據(jù)細胞類型而有很大差異。對于細胞裂解，我們需要培養(yǎng)細菌或酵母細胞來提取 DNA。細菌中存在的需要裂解以釋放細胞內(nèi)容物的細胞壁是通過使用溶菌酶進行的。使用的其他化學品是 EDTA 和 SDS 清潔劑。 EDTA 充當螯合劑并螯合作為酶的輔助因子的二價陽離子。 SDS 是一種陰離子去污劑，可破壞膜蛋白的二硫鍵并幫助膜蛋白降解。在植物的情況下，細胞壁通過酶處理（如使用果膠酶、纖維素酶等）降解。破壞植物和真菌細胞壁的替代方法是使用液氮（液氮）并將細胞壓碎/均質(zhì)化研缽杵。通過用溫和的陰離子去污劑 CTAB（十六烷基三甲基氨基溴）處理進行進一步的細胞裂解。 β-巰基乙醇可用于破壞硫鍵。
2. 酶處理
用 RNase 處理很容易從核酸混合物中去除 RNA，RNase 是一種非常熱穩(wěn)定的酶。 蛋白質(zhì)污染可以通過用蛋白酶 K 等蛋白水解酶消化去除。
3. 核酸純化：
※ 苯酚氯仿萃取
要獲得純 DNA 溶液，需要去除蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)。這是通過用苯酚或苯酚和氯仿的混合物萃取來實現(xiàn)的。苯酚和氯仿與水不混溶。當混合物被劇烈攪拌時，蛋白質(zhì)會變性；當以高速（12,000 rpm）離心時，脂質(zhì)和碳水化合物溶解在有機溶劑中并在相間沉淀。含有可溶性 DNA 的水相形成頂層，碎片形成底層。
※ 醇沉
苯酚萃取后，上述萃取得到的水相將不含蛋白質(zhì)雜質(zhì)，并且會被大量稀釋，因此濃縮樣品醇沉是通過使用冷凍乙醇或異丙醇沉淀核酸來完成的。在沉淀步驟之前加入少量 (1/10) 的 3M 乙酸鈉溶液。乙酸根離子有助于形成網(wǎng)絡(luò)，從而增強沉淀。加入酒精后，會出現(xiàn)沉淀，然后通過離心將其收集在試管底部。
※ 離心
如上段所述，在 DNA 純化中使用離心分離從溶液中分離細胞碎片和回收沉淀的核酸。可以使用的其他方法是氯化銫或 CsCl2 密度梯度離心，用于從細菌基因組 DNA 中分離質(zhì)粒 DNA，或從 DNA 中分離 RNA。在構(gòu)建基因組文庫時，蔗糖梯度還可用于大 DNA 片段的大小選擇。
※ 質(zhì)粒提取
美國分子生物學家 Joshua Lederberg 介紹了“質(zhì)粒”一詞。質(zhì)粒是細菌的染色體外DNA，可以獨立復(fù)制。它體積小，雙股，圓形。由于其自我復(fù)制的特性；它用于重組 DNA 實驗，以克隆其他生物的基因并制造大量的 DNA。質(zhì)?？梢栽谕晃锓N之間或不同物種之間轉(zhuǎn)移。質(zhì)粒大小范圍為 1-1000 公斤堿基對。
質(zhì)粒是可轉(zhuǎn)移的遺傳元件，也稱為“復(fù)制子”，是裸露的 DNA，是實驗室中的重要工具，通常用于繁殖或表達特定基因。
※ 堿性裂解
堿性裂解是一種在分子生物學中分離質(zhì)粒 DNA 的方法，其中具有所需質(zhì)粒的細菌細胞在堿性條件下被裂解。首先培養(yǎng)具有質(zhì)粒 DNA（感興趣的）的細菌，然后用堿性裂解緩沖液進行裂解。裂解緩沖液由去污劑十二烷基硫酸鈉 (SDS) 和強堿 NaOH（氫氧化鈉）組成。去污劑裂解膜磷脂雙分子層，而堿有助于使參與維持細胞膜結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)變性。通過一系列涉及攪拌、沉淀、離心和去除上清液的步驟，去除細胞碎片，分離純化質(zhì)粒。
在任何類型的 DNA 分離中，蛋白質(zhì)都是污染劑，在質(zhì)粒 DNA 分離中也是如此。它們會干擾最終產(chǎn)品并導(dǎo)致產(chǎn)量低。 SDS 用于使蛋白質(zhì)變性并促進 DNA 純化過程。瓊脂糖凝膠電泳是一種強大的分離方法，常用于分析質(zhì)粒 DNA。
同一質(zhì)粒 DNA 分子的不同形式具有以下遷移率（按降序排列）：
超級盤繞 > 線性 > 刻痕圓 > 二聚體 > 三聚體 > 等。
※ 柱純化
核酸純化主要有兩種色譜法：
1. 尺寸排阻色譜
2. 親和層析。
排除色譜法中，樣品混合物通過小珠的基質(zhì)傳遞。較小的分子（例如鹽和某些核苷酸）將進入珠子，而較大的分子（例如較長的核酸）將穿過柱。
在親和色譜法中，大分子將與柱樹脂結(jié)合。樹脂可以是陰離子樹脂或寡-DT序列，該序列特異性結(jié)合了真核mRNA分子的多A尾。在兩種色譜中，可以從色譜柱上洗滌不良的分子，并且可以通過改變pH條件或其他條件來洗脫與柱結(jié)合的核酸的洗脫。
分光光度計的定量：確定DNA產(chǎn)量和純度的最常見技術(shù)是測量吸光度。 DNA和RNA的純制劑的OD260/OD280值分別為1.8至2.0。如果該比率的值大于1.8的DNA樣品，則樣品中將有RNA污染。如果由于蛋白質(zhì)或苯酚而引起的污染，與上述值相比，比率降低，并且無法找到準確的值。如果樣品是純凈的，則可以使用分光光度計來測量由堿吸收的紫外線輻射量。 （紫外線光譜法是蛋白質(zhì)最敏感的不穩(wěn)定的無不穩(wěn)定定量方法）。
