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蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)怎么做
Release Time：2020-07-20一、蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)介紹：
蛋白質(zhì)印跡，是一種標(biāo)記方法（印跡法）是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相支持物上，然后使用相應(yīng)的檢測(cè)反應(yīng)來(lái)檢測(cè)一種方法。使用DNA-RNA交叉檢測(cè)特定DNA片段的方法稱為South標(biāo)記法。后來(lái)，人們使用類似的方法標(biāo)記和分析RNA和蛋白質(zhì)。 RNA的分離和分析稱為North標(biāo)記。單向電泳后蛋白質(zhì)分子的斑點(diǎn)分析稱為蛋白質(zhì)斑點(diǎn)法，斑點(diǎn)分析稱為東部斑點(diǎn)法。
二，蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)方法：
※ 蛋白質(zhì)印跡（blotting）是將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上后，利用相對(duì)應(yīng)的探測(cè)反應(yīng)來(lái)檢測(cè)樣品的一種實(shí)驗(yàn)方法。蛋白質(zhì)標(biāo)記法首先將電泳后分離的蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。通常有兩種方法：插入標(biāo)記法和電泳法。在濕濾紙上，將硝酸纖維素膜放在凝膠上，然后在濾紙上放一層吸水材料，然后用重物壓，緩沖液將通過(guò)毛細(xì)管作用流過(guò)凝膠。
※ 當(dāng)緩沖液通過(guò)凝膠時(shí)，蛋白質(zhì)被帶到了硝酸纖維素膜表面，硝酸纖維素膜可以通過(guò)疏水的相互作用與蛋白質(zhì)進(jìn)行不可逆的結(jié)合。這個(gè)持續(xù)的過(guò)程會(huì)繼續(xù)升溫，此時(shí)凝膠中的蛋白質(zhì)基本可以轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。
該方法雖然具有較高的轉(zhuǎn)移效率，但通常只能轉(zhuǎn)移凝膠中約（10％?20％）的一小部分蛋白質(zhì)。電泳分離可以更快速和更有效地的實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)移。該實(shí)驗(yàn)方法采用多孔塑料板和有機(jī)玻璃板，將凝膠以及硝酸纖維素膜夾在中間，形成了“三明治”狀態(tài)，再將其浸入兩個(gè)平行電極之間的緩沖液中進(jìn)行電泳。選擇合適的電泳方向以使蛋白質(zhì)離開(kāi)凝膠并結(jié)合到硝酸纖維素膜上。轉(zhuǎn)移的硝酸纖維素膜稱為斑點(diǎn)（印跡），可用于進(jìn)一步的進(jìn)行蛋白質(zhì)的檢測(cè)。
三，蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)步驟：
※ 首先用蛋白質(zhì)溶液（例如10％BSA）處理比對(duì)，以阻斷硝酸纖維素膜上剩余的疏水結(jié)合位點(diǎn)，然后用待研究蛋白質(zhì)的抗血清（一抗）處理，僅待研究蛋白質(zhì)被分離。它與一抗結(jié)合，但其他蛋白質(zhì)不與一抗結(jié)合，因此在除去未結(jié)合的一抗后，只有待研究蛋白質(zhì)的位置與過(guò)濾器中的一抗結(jié)合。
※ 用適當(dāng)標(biāo)記的第二抗體進(jìn)一步處理處理過(guò)的壓縮物。二抗是指一抗的抗體。如果一級(jí)抗體是從小鼠獲得的，則二級(jí)抗體是針對(duì)小鼠Ig G的抗體。經(jīng)過(guò)處理后，標(biāo)記的二級(jí)抗體會(huì)與一級(jí)抗體結(jié)合，這可以指示一級(jí)抗體的位置，即要研究的蛋白質(zhì)。
當(dāng)前，存在結(jié)合各種標(biāo)志物的抗特異性Ig G抗體，并且可以作為標(biāo)記的第二抗體直接購(gòu)買。最常用的一種是酶聯(lián)二抗。用酶聯(lián)二抗處理標(biāo)記后，用適當(dāng)?shù)牡孜锶芤禾幚順?biāo)記。當(dāng)酶純化的底物產(chǎn)生有色產(chǎn)物時(shí)，將產(chǎn)生可見(jiàn)帶。指示要研究的蛋白質(zhì)的位置。
※ 堿性磷酸酶可將無(wú)色底物5-溴-4-氯代二甲苯磷酸（BCIP）轉(zhuǎn)化為藍(lán)色產(chǎn)物。過(guò)氧化物酶可以使用H2O2作為底物將3- Amino-9-自由基咔唑氧化為棕色產(chǎn)品，或?qū)?-氯苯酚氧化為藍(lán)色產(chǎn)品。檢測(cè)辣根過(guò)氧化物酶的另一種方法是使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光。辣根過(guò)氧化物酶氧化化學(xué)發(fā)光物質(zhì)魯米諾（luminol，氨基鄰苯二甲酰單酯）并在H2O2存在下發(fā)光。在化學(xué)增強(qiáng)劑的存在下，光強(qiáng)度可以提高1000倍，而將辣根過(guò)氧化物酶的存在可以通過(guò)將副本放在攝影膠片上并使其敏化來(lái)檢測(cè)。
除了作為指標(biāo)的酶聯(lián)二抗外，還可以使用其他指標(biāo)，主要包括以下各項(xiàng)：
I125標(biāo)記的二抗：可以通過(guò)放射自顯影檢測(cè)。
異硫氰酸熒光素標(biāo)記的二抗：可以通過(guò)在紫外線下產(chǎn)生熒光來(lái)檢測(cè)。
I125標(biāo)記的金黃色葡萄球菌蛋白質(zhì)A（蛋白質(zhì)A）：蛋白質(zhì)A可以結(jié)合到Ig G本身的Fc區(qū)，因此蛋白質(zhì)A可以替代第二抗體：通過(guò)紅外放射自顯影檢測(cè)I125標(biāo)記的蛋白質(zhì)A。
金標(biāo)記的二抗：二抗包裝有微小的金顆粒，與一抗結(jié)合使用時(shí)可能會(huì)顯示紅色。生物素偶聯(lián)的二抗：用生物素偶聯(lián)的二抗過(guò)濾后，用堿性磷酸酶或辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的凝集素處理。生物素可以與凝集素緊密結(jié)合。該方法實(shí)際上等效于通過(guò)生物素和凝集素的緊密結(jié)合將二抗與酶連接，并且可以通過(guò)酶的顯色反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)。該方法的優(yōu)勢(shì)在于，由于生物素是一種小分子蛋白質(zhì)，一種抗體可以結(jié)合多種生物素，而這些生物素也可以結(jié)合多種酶聯(lián)的凝集素，從而可以大大增強(qiáng)顯色反應(yīng)信號(hào)。除了使用抗體或蛋白質(zhì)作為探針來(lái)檢測(cè)特定蛋白質(zhì)外，有時(shí)還可以使用其他探針（例如反復(fù)標(biāo)記的DNA）來(lái)檢測(cè)標(biāo)記中的DNA結(jié)合蛋白。
四，蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)所需試劑
| 序列 | 產(chǎn)品名 | 貨號(hào) | CAS | 備注 |
| 1 | 纖維素乙酸酯丙酸酯 | LSH78330 | 9004-39-1 | |
| 2 | 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液 | HC1785 | ||
| 3 | Ig G | SC0364 | 10047-33-3 | |
| 4 | 堿性磷酸酶 | HC1779 | ||
| 5 | 5-溴-4-氯代二甲苯磷酸（BCIP） | JT7275 | 102185-49-9 | |
| 6 | H2O2 | HCR207671 | 7722-84-1 | |
| 7 | 4-氯苯酚 | JT24020 | 106-48-9 | |
| 8 | 異硫氰酸 | SS4104 | 593-84-0 | |
| 9 | 蛋白內(nèi)切酶 Glu-C 來(lái)源于金黃色葡萄球菌 V8 | SS0249 | 66676-43-5 | |
| 10 | 生物素 DHPE | LSH50144 | 136235-58-0 |
