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蛋白質(zhì)印跡實驗怎么做
Release Time：2020-07-20一、蛋白質(zhì)印跡實驗介紹：
蛋白質(zhì)印跡，是一種標記方法（印跡法）是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相支持物上，然后使用相應的檢測反應來檢測一種方法。使用DNA-RNA交叉檢測特定DNA片段的方法稱為South標記法。后來，人們使用類似的方法標記和分析RNA和蛋白質(zhì)。 RNA的分離和分析稱為North標記。單向電泳后蛋白質(zhì)分子的斑點分析稱為蛋白質(zhì)斑點法，斑點分析稱為東部斑點法。
二，蛋白質(zhì)印跡實驗方法：
※ 蛋白質(zhì)印跡（blotting）是將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上后，利用相對應的探測反應來檢測樣品的一種實驗方法。蛋白質(zhì)標記法首先將電泳后分離的蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。通常有兩種方法：插入標記法和電泳法。在濕濾紙上，將硝酸纖維素膜放在凝膠上，然后在濾紙上放一層吸水材料，然后用重物壓，緩沖液將通過毛細管作用流過凝膠。
※ 當緩沖液通過凝膠時，蛋白質(zhì)被帶到了硝酸纖維素膜表面，硝酸纖維素膜可以通過疏水的相互作用與蛋白質(zhì)進行不可逆的結合。這個持續(xù)的過程會繼續(xù)升溫，此時凝膠中的蛋白質(zhì)基本可以轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。
該方法雖然具有較高的轉(zhuǎn)移效率，但通常只能轉(zhuǎn)移凝膠中約（10％?20％）的一小部分蛋白質(zhì)。電泳分離可以更快速和更有效地的實現(xiàn)轉(zhuǎn)移。該實驗方法采用多孔塑料板和有機玻璃板，將凝膠以及硝酸纖維素膜夾在中間，形成了“三明治”狀態(tài)，再將其浸入兩個平行電極之間的緩沖液中進行電泳。選擇合適的電泳方向以使蛋白質(zhì)離開凝膠并結合到硝酸纖維素膜上。轉(zhuǎn)移的硝酸纖維素膜稱為斑點（印跡），可用于進一步的進行蛋白質(zhì)的檢測。
三，蛋白質(zhì)印跡實驗步驟：
※ 首先用蛋白質(zhì)溶液（例如10％BSA）處理比對，以阻斷硝酸纖維素膜上剩余的疏水結合位點，然后用待研究蛋白質(zhì)的抗血清（一抗）處理，僅待研究蛋白質(zhì)被分離。它與一抗結合，但其他蛋白質(zhì)不與一抗結合，因此在除去未結合的一抗后，只有待研究蛋白質(zhì)的位置與過濾器中的一抗結合。
※ 用適當標記的第二抗體進一步處理處理過的壓縮物。二抗是指一抗的抗體。如果一級抗體是從小鼠獲得的，則二級抗體是針對小鼠Ig G的抗體。經(jīng)過處理后，標記的二級抗體會與一級抗體結合，這可以指示一級抗體的位置，即要研究的蛋白質(zhì)。
當前，存在結合各種標志物的抗特異性Ig G抗體，并且可以作為標記的第二抗體直接購買。最常用的一種是酶聯(lián)二抗。用酶聯(lián)二抗處理標記后，用適當?shù)牡孜锶芤禾幚順擞?。當酶純化的底物產(chǎn)生有色產(chǎn)物時，將產(chǎn)生可見帶。指示要研究的蛋白質(zhì)的位置。
※ 堿性磷酸酶可將無色底物5-溴-4-氯代二甲苯磷酸（BCIP）轉(zhuǎn)化為藍色產(chǎn)物。過氧化物酶可以使用H2O2作為底物將3- Amino-9-自由基咔唑氧化為棕色產(chǎn)品，或?qū)?-氯苯酚氧化為藍色產(chǎn)品。檢測辣根過氧化物酶的另一種方法是使用增強的化學發(fā)光。辣根過氧化物酶氧化化學發(fā)光物質(zhì)魯米諾（luminol，氨基鄰苯二甲酰單酯）并在H2O2存在下發(fā)光。在化學增強劑的存在下，光強度可以提高1000倍，而將辣根過氧化物酶的存在可以通過將副本放在攝影膠片上并使其敏化來檢測。
除了作為指標的酶聯(lián)二抗外，還可以使用其他指標，主要包括以下各項：
I125標記的二抗：可以通過放射自顯影檢測。
異硫氰酸熒光素標記的二抗：可以通過在紫外線下產(chǎn)生熒光來檢測。
I125標記的金黃色葡萄球菌蛋白質(zhì)A（蛋白質(zhì)A）：蛋白質(zhì)A可以結合到Ig G本身的Fc區(qū)，因此蛋白質(zhì)A可以替代第二抗體：通過紅外放射自顯影檢測I125標記的蛋白質(zhì)A。
金標記的二抗：二抗包裝有微小的金顆粒，與一抗結合使用時可能會顯示紅色。生物素偶聯(lián)的二抗：用生物素偶聯(lián)的二抗過濾后，用堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶標記的凝集素處理。生物素可以與凝集素緊密結合。該方法實際上等效于通過生物素和凝集素的緊密結合將二抗與酶連接，并且可以通過酶的顯色反應進行檢測。該方法的優(yōu)勢在于，由于生物素是一種小分子蛋白質(zhì)，一種抗體可以結合多種生物素，而這些生物素也可以結合多種酶聯(lián)的凝集素，從而可以大大增強顯色反應信號。除了使用抗體或蛋白質(zhì)作為探針來檢測特定蛋白質(zhì)外，有時還可以使用其他探針（例如反復標記的DNA）來檢測標記中的DNA結合蛋白。
四，蛋白質(zhì)印跡實驗實驗所需試劑
| 序列 | 產(chǎn)品名 | 貨號 | CAS | 備注 |
| 1 | 纖維素乙酸酯丙酸酯 | LSH78330 | 9004-39-1 | |
| 2 | 標準蛋白質(zhì)溶液 | HC1785 | ||
| 3 | Ig G | SC0364 | 10047-33-3 | |
| 4 | 堿性磷酸酶 | HC1779 | ||
| 5 | 5-溴-4-氯代二甲苯磷酸（BCIP） | JT7275 | 102185-49-9 | |
| 6 | H2O2 | HCR207671 | 7722-84-1 | |
| 7 | 4-氯苯酚 | JT24020 | 106-48-9 | |
| 8 | 異硫氰酸 | SS4104 | 593-84-0 | |
| 9 | 蛋白內(nèi)切酶 Glu-C 來源于金黃色葡萄球菌 V8 | SS0249 | 66676-43-5 | |
| 10 | 生物素 DHPE | LSH50144 | 136235-58-0 |
