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鈣離子成像原料？
Release Time：2022-10-02鈣離子成像原料？鈣熒光探針實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)
鈣（Ca2+）是一種重要離子，在多種細(xì)胞功能中發(fā)揮作用。作為一個(gè)小離子，它可以在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞隔室中自由快速移動(dòng)。Ca2+可以作為從肌肉細(xì)胞（肌細(xì)胞）到神經(jīng)元和其他許多細(xì)胞活動(dòng)的快速指示劑。該領(lǐng)域的工作可以追溯到20世紀(jì)70年代Roger Tsien及其合作者在EGTA的Ca2+螯合特性方面的開創(chuàng)性工作。在此后的幾年里，鈣指示劑（Ca2+指示劑）的發(fā)展繼續(xù)為細(xì)胞生物學(xué)的基礎(chǔ)提供了深刻的見解，例如，細(xì)胞在不同疾病狀態(tài)下的反應(yīng)，或?qū)χ委熕幬锏姆磻?yīng)。在本文中，我們將研究用于監(jiān)測(cè)鈣信號(hào)、局部鈣水平的不同熒光指示劑，并研究它們?cè)诩?xì)胞和隔室中的流量或空間動(dòng)態(tài)。
單波長(zhǎng)鈣測(cè)量
使用最方便、最快的Ca2+指示劑是單波長(zhǎng)染料。這些通常用于指示活動(dòng)，它們對(duì)共焦成像更友好，因?yàn)樗鼈兺ǔＥc常見的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)以及光源相匹配。
Fluo-4相對(duì)明亮且穩(wěn)定，因此可以在較短的曝光時(shí)間內(nèi)獲得強(qiáng)信號(hào)，并且光毒性最小，因?yàn)樗膊恍枰a(chǎn)生更多活性氧的紫外線波長(zhǎng)。Fluo-4是一種低親和力的Ca2+指示劑，這意味著它可以在飽和前測(cè)量高Ca2+濃度，但在低Ca2+濃度（如靜息細(xì)胞的Ca2+濃度）下測(cè)量效果不佳。在單波長(zhǎng)測(cè)量中，通常使用比率F（t）/F（0）比較活動(dòng)期間的熒光發(fā)射與靜止?fàn)顟B(tài)的熒光發(fā)射。Ca2+濃度的定性測(cè)量可以通過這種方式實(shí)現(xiàn)，但這對(duì)定量測(cè)量造成了限制，需要對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化，以解釋實(shí)驗(yàn)內(nèi)和實(shí)驗(yàn)間的變化。潛在問題包括研究期間細(xì)胞的染料負(fù)載不均勻、光漂白和染料從細(xì)胞中泄漏。
Rhod Dyes
另一組單波長(zhǎng)Ca2+指示劑是Rhod染料。雖然應(yīng)用不太廣泛，但值得注意的是，它們將激發(fā)和發(fā)射轉(zhuǎn)移到更長(zhǎng)的波長(zhǎng)。例如，X-rhod-1的激發(fā)波長(zhǎng)為580 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為600 nm。這種波長(zhǎng)向紅色偏移的原理有助于減少組織內(nèi)的光毒性、自體熒光和光散射效應(yīng)，因此紅色區(qū)域的Ca2+指示劑數(shù)量繼續(xù)增加。在更長(zhǎng)波長(zhǎng)下工作的另一個(gè)好處是允許與其他熒光蛋白標(biāo)記進(jìn)行多路復(fù)用，或者可能促進(jìn)使用通道視紫紅質(zhì)對(duì)膜電位的光遺傳學(xué)控制（Lock et al.，2015）。
細(xì)胞內(nèi)鈣Fura-2，Indo-1的比例染料
定量染料對(duì)定量工作很有用，因?yàn)樗鼈兛梢孕Ｕ上駰l件和樣品制備中的許多變化，例如染料濃度的變化或光漂白效應(yīng)。這允許在不同實(shí)驗(yàn)之間對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行校準(zhǔn)和標(biāo)準(zhǔn)化。比例Ca2+指示劑的發(fā)射光譜或吸收光譜隨著局部Ca2+濃度的變化而發(fā)生變化。這些染料的乙酰甲氧基（AM）酯化形式是首選的，因?yàn)樗鼈冊(cè)诩?xì)胞膜上擴(kuò)散，并被細(xì)胞內(nèi)酯酶裂解，使細(xì)胞裝載過程更容易和有效。
Fura-2
在所有比例鈣離子指示劑中，F(xiàn)ura-2最為著名。Fura-2在340 nm和380 nm處表現(xiàn)出不同的吸收，這是Ca2+的函數(shù)（見下圖）。通過510nm左右的相對(duì)發(fā)射強(qiáng)度可以檢測(cè)到這種變化。
因此，F(xiàn)ura-2的成像協(xié)議比單波長(zhǎng)Ca2+指示劑的成像協(xié)議更復(fù)雜，并且需要能夠在340 nm和380 nm處提供照明的光源。Fura-2成像需要340 nm和380 nm的連續(xù)照明，檢測(cè)波長(zhǎng)為510 nm，然后計(jì)算這對(duì)發(fā)射圖像的像素比率。通過對(duì)自由離子濃度進(jìn)行校準(zhǔn)，可以進(jìn)一步分析圖像。Fura-2對(duì)Ca2+具有很高的親和力，因此非常適合在低水平下精確定量測(cè)量Ca2+，但不適用于非常高的濃度（通常高于1μM）。然而，有一些Fura-2染料的親和力較低，可以在較高的Ca2+濃度下進(jìn)行測(cè)量。
Indo-1
另一種著名的比例染料是Indo-1，但在這種情況下，染料在405 nm和485 nm處的兩個(gè)峰值附近改變其發(fā)射效率。Indo-1的激發(fā)波長(zhǎng)約為340 nm，可以用以405 nm和485 nm發(fā)射峰為中心的濾光片依次成像。
與Fura-2一樣，圖像是像素級(jí)的，可以根據(jù)游離Ca2+濃度進(jìn)行校準(zhǔn)。Indo-1的一個(gè)潛在問題是，在某些實(shí)驗(yàn)條件下，它可能相對(duì)不穩(wěn)定。它通常用于流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量，而這不是問題。
