Cal-520 AM鈣離子熒光探針使用方法推薦:
1. 帶有 Cal-520®,AM 的稱重傳感器：
AM 酯是非極性酯，可以很容易地穿過活細(xì)胞膜，并被活細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞酯酶迅速水解。 AM 酯廣泛用于將各種極性熒光探針無創(chuàng)地加載到活細(xì)胞中。但是，使用 AM 酯時必須小心，因為它們?nèi)菀姿?，尤其是在溶液中。它們?yīng)在使用高質(zhì)量無水二甲基亞砜 (DMSO) 前重新配制。 DMSO 儲備溶液可在 –20 °C 下干燥保存并避光。在這些條件下，AM 酯應(yīng)能穩(wěn)定數(shù)月。以下是我們推薦的將 Cal-520® AM、Cal-590™ AM 或 Cal-630™ AM 酯裝入活細(xì)胞的方案。本協(xié)議僅提供指導(dǎo)方針，應(yīng)根據(jù)您的具體需求進(jìn)行修改。
a) 在高質(zhì)量無水 DMSO 中制備 2 至 5 mM Cal-520® AM 儲備溶液。
b) 在實驗當(dāng)天，將 Cal-520® AM 溶解在 DMSO 中或?qū)⒌确值闹甘緞﹥淙芤航鈨鲋潦覝?。?Hanks and Hepes 緩沖液 (HHBS) 或您選擇的含有 0.04% Pluronic® F-127 的緩沖液中制備 10 到 20 µM 的染料工作溶液。細(xì)胞加載所需的指示劑的確切濃度必須憑經(jīng)驗確定。
注意：非離子洗滌劑 Pluronic® F-127 有時用于增加 Cal-520® AM 的水溶性。
c) 如果您的細(xì)胞（例如 CHO 細(xì)胞）含有有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運體，則可以將丙磺舒 (1-2 mM) 添加到染料工作溶液中（最終孔濃度為 0.5-1 mM）以減少染料泄漏脫酯指示劑。
d) 將等體積的染料工作溶液（來自步驟 b 或 c）添加到您的細(xì)胞板中。
e) 將染料加載板在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育 60 至 90 分鐘，然后在室溫下再孵育 30 分鐘。
注意：孵育染料超過 2 小時可為某些細(xì)胞系提供更好的信號強度。
f) 用 HHBS 或您選擇的包含陰離子轉(zhuǎn)運蛋白抑制劑（例如 1 mM 丙磺舒）的緩沖液替換染料工作溶液，以去除多余的探針。
g) 在 Ex/Em = 490/525 nm（對于 Cal-520® AM）、540/590 nm 下運行實驗
2. 測量細(xì)胞內(nèi)鈣反應(yīng)：

圖 1. 沒有丙磺舒的 CHO-M1 細(xì)胞中內(nèi)源性 P2Y 受體對 ATP 的反應(yīng)。 CHO-M1 細(xì)胞以每孔 40,000 個細(xì)胞每孔 40,000 個細(xì)胞接種在 96 孔黑壁/透明底部肋板中過夜。 將 100 µl 4 µM Fluo-3 AM、Fluo-4 AM 或 Cal 520® AM 的 HHBS 溶液加入孔中，并將細(xì)胞在 37 °C 下孵育 2 小時。 將染料加載介質(zhì)替換為 100 µl HHBS，加入 50 µl 300 µM ATP，然后使用 FITC 通道在熒光顯微鏡（Olympus IX71）上成像。

圖 2. 使用 Cal-520® 或 Fluo-4 AM 測量的 CHO-K1 細(xì)胞中內(nèi)源性 P2Y 受體的 ATP 刺激鈣反應(yīng)。 CHO-K1 細(xì)胞以每孔 50,000 個細(xì)胞每孔 50,000 個細(xì)胞的形式接種在 96 孔黑壁/透明底部肋板中過夜。 將 100 µL 5 µM Fluo-4 AM 或 Cal-520® AM（含（A）或不含（B）2.5 mM 丙磺舒）加入細(xì)胞中，并將細(xì)胞在 37oC 下培養(yǎng) 2 小時。 由 FlexStation（Molecular Devices）添加 ATP（50 µL/孔）以達(dá)到最終指示濃度。

圖 3. CHO-K 細(xì)胞中內(nèi)源性 P2Y 受體對 ATP 的反應(yīng)。 CHO-K 細(xì)胞以每孔 40,000 個細(xì)胞每孔 40,000 個細(xì)胞接種在 96 孔黑壁/透明底部肋板中過夜。 將 100 µl 含 1 mM 丙磺舒的 HHBS 中的 4 µM Cal 590™ AM 或 Cal 630™ AM 加入孔中，并將細(xì)胞在 37 °C 下孵育 2 小時。 用 100 µl HHBS 和 1 mM 丙磺舒替換染料加載培養(yǎng)基，然后在加入 50 µl 300 µM ATP 之前和之后使用 TRITC 通道在熒光顯微鏡（Olympus IX71）上成像。