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Fluo-4 AM 鈣熒光探針 介紹：
Fluo-4 AM 是最常用的檢測細胞內(nèi)鈣離子濃度的熒光探針之一。Fluo-4 AM將Fluo-3 AM結構中的氯原子替換成了氟原子，導致它的最大激發(fā)波長會向短波長處偏離10 nm左右。這個波長更接近于氬激光器的波長488 nm，所以用氬激光器激發(fā)時，F(xiàn)luo-4的熒光強度會比Fluo-3強一倍。由于Fluo-4與鈣離子的親和力和Fluo-3相近，所以使用上和Fluo-3基本相同，可以使用激光共聚焦顯微鏡或流式細胞儀檢測細胞內(nèi)鈣離子濃度的變化。
Fluo-4 AM是Fluo-4的乙酰甲酯衍生物，能夠穿透細胞膜進入細胞中。Fluo-4 AM進入細胞后可以被細胞內(nèi)的酯酶剪切形成Fluo-4，從而被滯留在細胞內(nèi)。Fluo-4可以和鈣離子結合，結合鈣離子后可以產(chǎn)生較強的熒光，最大激發(fā)波長為494 nm，最大發(fā)射波長為516 nm。
Fluo-4 AM(鈣離子熒光探針) 是配制于無水DMSO (anhydrous DMSO)中的儲存母液，濃度為2mM。
用于細胞內(nèi)鈣離子檢測時，F(xiàn)luo-4 AM的常用濃度為0.5-5 μM。通常用含有0.5-5μM的Fluo-4 AM的適當溶液和細胞一起在20-37℃孵育10-60分鐘進行熒光探針裝載，隨后適當洗滌，洗滌后可以考慮適當再孵育20-30分鐘以確保Fluo-4 AM在細胞內(nèi)充分轉(zhuǎn)變成Fluo-4。

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Fluo-4 AM實驗步驟：
1、所需試劑：
※ 2 mM的 Fluo-4, AM（DMSO）試劑溶液，將1mg的Fluo-4, AM溶進442µL的DMSO中；
※ Pluronic F127； Hanks balanced salt solution（HBSS）
※ HEPES buffer saline（10mM HEPES，1mM Na2HPO4，137mM NaCl，5mM KCl，1mM CaCl2，0.5mM MgCl2，5mM glucose，0.1% BSA，pH 7.4）
2、實驗步驟：
※ 向Fluo-4, AM/DMSO溶液中加入16.5mg的Pluronic F127，Pluronic F127可以防止 Fluo-4, AM在HBSS緩沖液中聚合，同時可以幫助其進入細胞；
※ 用 HBSS緩沖液 稀釋 Fluo-4, AM溶液，制備出 4µM的Fluo-4, AM溶液；
※ 將制備好的Fluo-4, AM溶液加入細胞中，在37℃條件下培養(yǎng)約20分鐘；
※ 加5倍體積且含有 1%胎牛血清 的HBSS緩沖液后，繼續(xù)培養(yǎng)月40分鐘；
※ 用 HEPES buffer saline進行洗滌細胞3次后，再用 HEPES buffer saline使細胞重懸浮，制備成 1×105 cells/mL溶液。
※ 37℃條件下培養(yǎng)約10分鐘，再該細胞進行熒光鈣離子的檢測。熒光波長：激發(fā)波長494nm，發(fā)射波長516nm。

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熒光圖譜

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鈣熒光探針 Fluo-4 AM 實驗注意事項：
1. Fluo-4 AM遇水極易分解，建議第一次使用時，母液分裝并密封保存，同時注意保持干燥。
2. Fluo-4 AM在4℃、冰浴等較低溫度情況下會凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內(nèi)，可以20-25℃水浴溫育片刻至全部融解后使用。
3. 探針的工作濃度、細胞量、孵育溫度和時間等需要根據(jù)不同實驗預先摸索。
4. 熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。
5.實驗前需戴好防護眼鏡，穿戴防護服和口罩，佩戴手套，避免與皮膚接觸。
6.實驗過程中如遇到有毒或者刺激性物質(zhì)及有害物質(zhì)產(chǎn)生，必要時實驗操作需要手套箱內(nèi)完成以免對實驗人員造成傷害
7.實驗后產(chǎn)生的廢棄物需分類存儲，并交于專業(yè)生物廢氣物處理公司處理，以免造成環(huán)境污染Experimental considerations:

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1. Wear protective glasses, protective clothing and masks, gloves, and avoid contact with the skin during the experiment.
2. The waste generated after the experiment needs to be stored separately, and handed over to a professional biological waste gas treatment company to avoid environmental pollution.

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