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NBD C6-Ceramide(86701-10-2,NBD C6-神經(jīng)酰胺)說明：
NBD C6-Ceramide （also as C-6 NBD ceramide） is a fluorescent sphingolipid analogue that is permeable to cell membranes and is a vital stain for the Golgi apparatus, endoplasmic reticulum, and nuclear envelope of mammalian cells. In the presence of 10 microM monensin (sc-200109) the visibility of the fluorescence is diminished on the plasma membrane, whereas the appearance of the Golgi apparatus is amplified. C-6 NBD ceramide has been known to produce the two fluorescent metabolites sphingomyelin and glucocerebroside intracellularly in the Golgi apparatus, which are then transported to the cell surface. In addition, monensin inhibits the ability to remove the fluorescent metabolites sphingomyelin and glucocerebroside from the cell surface by back exchange.

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實(shí)驗(yàn)步驟：
一、制備 NBD C6-Ceramide-BSA 復(fù)合物
對于活細(xì)胞或固定細(xì)胞的染色，使用添加 BSA 的 NBD C6-Ceramide-BSA 復(fù)合物能夠得到較好的染色效果。NBD C6-Ceramide-BSA 復(fù)合物制備方法如下：
1. 以氯仿：乙醇（體積比 19:1）為溶劑配制 1 mM NBD C6-Ceramide 溶液；
2. 吸取 50 µl NBD C6-Ceramide 溶液于小玻璃試管中，保持干燥，通入氮?dú)饬?，然后在真空狀態(tài)保持至少 1 小時，以 200 µl 無水乙醇重溶。
3. 量取 10 ml 無血清的平衡鹽溶液（如 HBSS 或 HEPES，pH 7.4）到 50 ml 塑料離心管中，加入 3.4 mg（使其濃度為 0.34 mg/ml）的脫脂 BSA。
4. 將含有 10 ml BSA 溶液的試管置于漩渦混合器上混勻，加入 200 µl NBD C6-Ceramide 溶液，漩渦震蕩混勻，所得溶液（5 µM NBD C6-Ceramide+5 µMBSA）保存于-20°C。
二、活細(xì)胞高爾基復(fù)合體染色
1. 用合適的緩沖液（如 HBSS/HEPES）沖洗蓋玻片上的細(xì)胞；
2. 加入 5 µM NBD C6-Ceramide+5 µM BSA 溶液于 4°C 孵育細(xì)胞 30 分鐘；
3. 用預(yù)冷的新鮮培養(yǎng)基反復(fù)沖洗細(xì)胞數(shù)次，37°C 孵育細(xì)胞 30 分鐘；
4. 用新鮮培養(yǎng)基沖洗細(xì)胞，熒光顯微鏡鏡檢。
三、經(jīng)過固定處理的細(xì)胞高爾基復(fù)合體染色
注意：染色條件同活細(xì)胞樣品，但應(yīng)避免使用含甲醇/丙酮類的固定劑。
1. 用 HBSS/HEPES 緩沖液沖洗蓋玻片上的細(xì)胞，用 0.5%戊二醛/10%蔗糖/100 mM的 PIPES 緩沖液（pH 7.0）或者 2~4%多聚甲醛（溶于 PBS）溶液室溫下固定5~10 分鐘；
2. 用預(yù)冷的 HBSS/HEPES 反復(fù)沖洗細(xì)胞數(shù)次，加入 5 µM NBD C6-Ceramide+5 µMBSA 溶液于 4°C 冰浴孵育 30 分鐘；
3. 用 HBSS/HEPES 沖洗細(xì)胞樣品，以 10%的 FBS 或者 2 mg/ml 的 BSA 在室溫下孵育 30~90 分鐘，以加強(qiáng)高爾基體染色效果；
4. 用新鮮的 HBSS/HEPES 將細(xì)胞樣品沖洗干凈，熒光顯微鏡鏡檢。

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光譜圖：

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NBD C6-神經(jīng)酰胺實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：
1.實(shí)驗(yàn)前需戴好防護(hù)眼鏡，穿戴防護(hù)服和口罩，佩戴手套，避免與皮膚接觸。
2.實(shí)驗(yàn)過程中如遇到有毒或者刺激性物質(zhì)及有害物質(zhì)產(chǎn)生，必要時實(shí)驗(yàn)操作需要手套箱內(nèi)完成以免對實(shí)驗(yàn)人員造成傷害
3.實(shí)驗(yàn)后產(chǎn)生的廢棄物需分類存儲，并交于專業(yè)生物廢氣物處理公司處理，以免造成環(huán)境污染Experimental considerations:
1. Wear protective glasses, protective clothing and masks, gloves, and avoid contact with the skin during the experiment.
2. The waste generated after the experiment needs to be stored separately, and handed over to a professional biological waste gas treatment company to avoid environmental pollution.

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