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提取病毒RNA的實驗方法
Release Time：2020-07-22一、病毒RNA提取方法介紹
二、提取病毒RNA的實驗試劑和耗材
| 序號 | 產(chǎn)品 | CAS號 | 貨號 | 備注 |
| 1 | 異硫氰酸胍 | 593-84-0 | SS4104 | |
| 2 | 異丙醇 | 67-63-0 | JT25997 | |
| 3 | 氯仿 | 865-49-6 | DD0008 | |
| 4 | 乙醇 | 64-17-5 | JT26000 | |
| 5 | 焦碳酸二乙酯（DEPC） | 1609-47-8 | JT22499 | |
| 6 | 1.5ml滅菌離心管 | F-EP015-H |
三、異硫氰酸胍的提取病毒RNA的實驗步驟
1.取200ul樣品+陰性對照+陽性對照，加入1.5ml無菌范德生物離心管；
2.加入600ul異硫氰酸胍，然后加入對照和樣品，再加入200ul氯仿，顛倒混合；
3.以13000rpm離心15分鐘；
4.離心第三步結(jié)束時，取相同數(shù)量的1.5ml無菌范德生物離心管，并加入在-20℃預(yù)冷的400ul異丙醇。
5.從離心第三步中取出上清液（確保不要吸收中間的白色層，并且在離心第三步后取出試管時，不要傾斜試管），將其轉(zhuǎn)移到準備好的試管中在第4步中，將其倒置混合；
6.以13000rpm離心15分鐘，輕輕倒出上清液，并在吸水紙上盡可能干燥液體。
7.加入600ul的75％乙醇，并顛倒數(shù)次，以洗滌剩余的異丙醇；
8.以13000rpm離心15分鐘，輕輕倒入上清液，并嘗試在吸水紙上干燥液體。
9.以4000rpm的速度離心10秒，將管壁上的剩余液體搖至底部，用微量移液器吸頭，并在室溫下干燥2-3分鐘（不要太干以防止RNA不溶于下一步）;
10.加入20ul DEPE水（在高壓下加入depc純水后的水為DEPE水），輕輕混合以溶解RNA。以2000rpm的速度離心5秒，然后保存在冰上備用（最好在2小時內(nèi)使用以避免RNA降解）。
四、TRIzol LS提取病毒RNA方法
提取物是血清，血液，細胞培養(yǎng)液，雞胚尿囊液和其他液體中的病毒。應(yīng)在人少的情況下進行提取，以防止空氣中RNase的污染。所用的一切也應(yīng)不含RNase。
1.將500ul病毒原液加入1.5ml范德生物離心管中，然后加入500ul TRIzol LS，充分混合，然后在室溫下放置10分鐘；
2.加入200ul氯仿，蓋上離心管蓋，用力搖晃離心管（溶液已完全乳化，呈乳白色，無相分離現(xiàn)象），并在室溫下放置10分鐘（因為氯仿具有沸點低且易揮發(fā)，搖動離心管可能會破裂（小心）；
3.在4°C下以13000r / min的轉(zhuǎn)速離心15分鐘，吸收上層液相并將其轉(zhuǎn)移到另一個試管中（不要抽吸白色中間相）；
4.加入等體積的異丙醇，輕輕倒轉(zhuǎn)離心管以充分混合液體，然后在室溫下放置10分鐘；
5.以13000r / min在4℃離心15分鐘。 （乍看之下，您會發(fā)現(xiàn)試管中什么也沒有。如果仔細觀察，您會發(fā)現(xiàn)試管底部附近的壁上有白色沉淀物。）小心吸掉所有上清液；
6.用1ml的75％乙醇洗滌，在4℃以8000r / min的速度離心10min，（然后您會發(fā)現(xiàn)試管再次是空的，不用擔心，有，但是因為量太小，您看不到）。干凈，在超干凈的臺中干燥5分鐘；
7.加入適量的DEPC處理水。 （如果材料來源豐富，則添加的水量是下一步RT的總量減去其他試劑的量；如果要節(jié)省使用量，您可以自己動手做，盡量不要添加過多水）;
8.建議立即進行RT。如果要儲存，則可以在上一步中添加乙醇后將其冷凍在-70°C下，并且可以保存一年；如果添加DEPC水，則只能在-20°C下保存約1個月。
五、Trizol提取病毒RNA方法（提取禽流感病毒的步驟供參考）
Trizol方法適用于人類，動物，植物以及微生物的組織或細菌培養(yǎng)。一般選擇樣品量可以從幾十毫克到幾克不等。
1.取雞胚尿囊液，加入5-10倍體積的Trizol液，然后攪拌均勻；
2.在室溫條件下放置大約5分鐘，然后以每1毫升Trizol溶液0.2ml的比例加入氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖動離心管15秒鐘；
3.將上層水相放入新的離心管中，以每毫升Trizol溶液0.5毫升異丙醇的比例添加異丙醇，在室溫下放置10分鐘，然后在12000克下離心10分鐘；
4.棄去上清液，每毫升Trizol溶液加入至少1ml的75％乙醇，充分混合，并在4°C下以7500g離心5分鐘；
5.重復步驟4；
6.小心丟棄上清液，然后在室溫下干燥5-10分鐘。注意不要將其過度干燥，否則會降低RNA的溶解度。
7.然后將RNA溶解在水中，靜置10分鐘。
六、提取病毒RNA實驗的注意事項
1.在整個實驗操作過程中，請戴好口罩和一次性手套，并盡可能降低操作強度；
2.加入氯仿前的勻漿可以在-70°C條件下保存約1個月以上，在70％乙醇中沉淀的RNA可以在4°C下保存1周，在-20°C下保存1年。
