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瓊脂糖凝膠回收DNA的常用方法
Release Time：2022-09-30一、瓊脂糖凝膠回收DNA的常用方法
1. 透析袋法
使用透析袋提取瓊脂糖凝膠是一種電洗脫過程。它涉及通過施加電流洗脫 DNA。原理是電場(chǎng)導(dǎo)致 DNA 條帶遷移出凝膠。 DNA 片段將被捕獲到透析膜中。首先，您需要將凝膠片在 -20°C 下冷凍 30 分鐘，以便于處理。
實(shí)驗(yàn)的步驟
※ 將5cm的透析袋剪開，開水活化10分鐘。激活后，用蒸餾水內(nèi)外沖洗，然后用 0.5 × TBE 緩沖液沖洗。用透析夾密封透析袋的一端，并將冷凍凝膠插入管內(nèi)。
※ 加入 200-400 µl，0.5 × TBE 緩沖液，并用第二個(gè)透析管密封管的另一端。之后，將透析袋浸入裝有電泳緩沖液的電泳槽中。DNA 條帶應(yīng)與電極平行并施加 5 V/cm 或 100 V 的電場(chǎng)。
※ 可以使用紫外燈跟蹤 DNA 遷移。 DNA 從凝膠中遷移出來需要 10-15 分鐘。遷移的 DNA 將向正端粘附在透析膜上。它會(huì)留在里面，但不會(huì)移出透析袋。
※ 輕輕反轉(zhuǎn)電流方向，將 DNA 從透析膜上敲下來。之后，從管中收集緩沖液并使用苯酚/氯仿提取和乙醇沉淀提取 DNA。將沉淀的 DNA 溶解在適當(dāng)體積 (10 µl) 的 TE 緩沖液或水中。
※ DNA 沉淀量很小，可能看不到。最終純化的樣品可以很容易地用于下游應(yīng)用。雖然這似乎是一個(gè)簡單的過程，但使用透析袋提取瓊脂糖凝膠并不是那么容易的協(xié)議。該方案比較耗時(shí)，且仍然涉及苯酚/氯仿萃取，然后是乙醇沉淀。
2. DEAE-纖維膜片法
※ 使用 DEAE 纖維素膜進(jìn)行瓊脂糖凝膠提取是電洗脫和旋轉(zhuǎn)柱的組合。在此過程中，使用手術(shù)刀片在所需 DNA 片段帶的正下方制作一個(gè)狹縫。但不要取下帶子，只需在它下面開一個(gè)口子。之后，剪下一小塊尺寸為 3 mm x 10 mm（與狹縫尺寸相同）的 DEAE 纖維素紙。
※ 將紙插入狹縫中，然后將凝膠返回到電泳槽中。運(yùn)行電泳 2-5 分鐘。在電泳過程中，DNA 會(huì)遷移出條帶并粘附在濾紙上。使用離心柱將 DNA 從紙條中洗脫出來。在此過程中可以使用紫外燈，以確保 DNA 已粘附在紙上。用針從內(nèi)向外在 500 µl 微量離心管底部的中心創(chuàng)建一個(gè)小孔。
3. DEAE-纖維素膜電泳
從凝膠中取出膜并將其（DNA 面朝下）放入 500 µl 微量離心管中。將 500 µl 試管放入 1.5 ml 離心管中。在 500 µl 試管中加入 100 µl TE 緩沖液，并以 5,000-10,000 rpm 的轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)試管 30 秒。離心后，DNA 將被洗脫到收集管 (1.5 ml) 中。繼續(xù)進(jìn)行苯酚/氯仿提取協(xié)議，然后進(jìn)行乙醇沉淀。這些后續(xù)步驟濃縮回收的 DNA，DNA 樣品可以重新懸浮在約 10 µl 的 TE 緩沖液中。
