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免疫熒光雙標操作方法及注意事項
Release Time：2022-09-21筆記：
1.選擇兩種不同IgG同種型的一抗。來自同一物種（例如小鼠 IgG1 和 IgG2a）或不同物種的不同亞組。確保您有匹配的二級熒光抗體。
2.決定覆蓋每張載玻片需要多少微升。通常，每個組織陣列需要 300-600ul 的每種孵育溶液。
3.除微波步驟外，程序在室溫下進行。
染色程序
1. 更換二甲苯使載玻片脫蠟，每次更換孵育載玻片 10 分鐘。
2.通過在兩次更換 100% 乙醇、兩次更換 95% 乙醇、一次更換 80% 乙醇、一次更換 70% 乙醇和兩次更換蒸餾水中，將玻片浸入水中 20-30 次，使其水化。
3.將載玻片放入微波載玻片盤中（塑料最適合塑料載玻片架）并用 50mM TRIS/20mM EDTA pH 9.0 緩沖液覆蓋（配方如下）。 （Kelli 在 van de Rijn 實驗室中使用 EDTA pH8）
4.1架載玻片高功率微波3分鐘，2架載玻片8分鐘，3架載玻片13分鐘。
5. 繼續(xù)以 80% 功率微波加熱 12 分鐘。 （時間可能因微波爐而異，但重要的是確保載玻片至少快速沸騰 10 分鐘并且不會變干。另外的緩沖液容器應與載玻片一起微波加熱，以便重新填充載玻片盤。 )
6.冷卻至少 30 分鐘。冷卻時間很關(guān)鍵。
7.用蒸餾水沖洗，X2。
8. 在 PBS 中沖洗 5 分鐘。
9. 在同一試管中將兩種選定的一抗在 PBS 中以正確的稀釋度混合。 （例如，對于 1:50 的 400 µl CD3 和 1:50 的 CD20，混合 4ul CD3 + 4ul CD20 + 392µl PBS）。
10. 在室溫下孵育 45 分鐘。
11. 在 PBS 中清洗載玻片 15 分鐘。
12.將在 PBS 中稀釋的二抗混合在同一管中（抗物種為 1:100，抗鏈霉親和素為 1:500。例如，對于 200 µl 抗物種：1 µl + 1 µl 熒光二抗 + 198 微升 PBS）。
13.在黑暗中孵育 45 分鐘。
14. 在 PBS 中（在黑暗中）洗滌載玻片 15 分鐘。
15.將載玻片安裝在含有 DAPI 的熒光封固劑中（ProLong antifade reagent with DAPI, Invitrogen cat#P36935）
16.將幻燈片放入暗盒中。它們可以在室溫下以這種方式儲存 3-4 周。
17.在熒光顯微鏡上使用正確的激發(fā)和濾光片查看。
解決方案：
50mM TRIS/20mM EDTA pH 9.0
12.1 g TRIS（可使用 Tris 或 Trizma）
1.48 克 EDTA 乙二胺四乙酸
用蒸餾水填充至 2 升。
調(diào)節(jié)至 pH 9.0
替代安裝介質(zhì)
1.0ml Dako 熒光封固劑
0.1ul DAPI
在小管中加入，并通過緩慢倒置管非常溫和地混合。
