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裂解和蛋白提取
Release Time：2022-09-19當純化的蛋白質(zhì)用于功能或結(jié)構(gòu)研究，或用于制備加工和生產(chǎn)時，首先要做的是破壞細胞或組織以獲得目的蛋白質(zhì)。 細胞裂解和蛋白質(zhì)溶解是高效分析和高效處理的關(guān)鍵步驟。 提取方法包括酶法、化學法、機械法或幾種方法的組合。
有多種方法可用于破壞細胞并準備??其內(nèi)容物以供分析。通常，當樣品由易于裂解的培養(yǎng)細胞或血細胞組成時，使用較溫和的方法，而更積極的方法用于破壞更堅固的細菌或植物細胞，或嵌入結(jié)締組織中的哺乳動物細胞。
※ 表面活性劑裂解方法：基于去污劑的裂解：去污劑裂解是一種較溫和的方法，適用于哺乳動物細胞、細菌細胞、酵母和植物。將細胞懸液輕輕離心并重懸于含有去污劑的裂解緩沖液中，去污劑可用于破壞細胞膜。溶解細胞膜，裂解細胞并釋放其內(nèi)容物。如果去污劑干擾分析或生產(chǎn)，則需要在下游處理中去除它們。
※ 凍融裂解法：該方法適用于哺乳動物或細菌細胞懸液。細胞懸液用液氮速凍。然后將樣品解凍并通過移液或在裂解緩沖液中輕輕渦旋重新懸浮，并重復此過程數(shù)次。在循環(huán)之間，將樣品離心并保留含有可溶性蛋白質(zhì)的上清液。
※ 滲透休克法：這是一種非常溫和的方法，無需使用表面活性劑即可裂解懸浮的哺乳動物或細菌細胞。這種方法通常與機械破碎技術(shù)相結(jié)合，依賴于從高滲透性介質(zhì)到低滲透性介質(zhì)的變化，非常適合隨后將裂解物分餾成亞細胞級分的應用。
※ 超聲處理：這種蛋白質(zhì)提取方法最常用于細胞懸液。將探針插入樣品中，細胞會被高頻聲波破壞。聲波產(chǎn)生導致細胞膜破裂的低壓區(qū)域。
※ 機械破碎技術(shù)：各種粗略但有效的“破碎和研磨”措施可用于從細胞和組織中提取蛋白質(zhì)。例如，液體剪切力可用于使用 Dounce 或 Potter-Elvehjem 均質(zhì)化方法破壞細胞膜。使用 Waring 攪拌器或 Polytron® 均質(zhì)器在冷卻的緩沖液中切碎或研磨組織來均質(zhì)化組織。在液氮中冷凍組織或細胞，加入氧化鋁或沙子，用研缽和研杵研磨成細粉。快速攪拌細胞和小玻璃珠會破壞細胞壁，對大多數(shù)革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌有效。
※ 酶法：酶法通常用于從細菌、酵母或真核細胞中提取蛋白質(zhì)，這些細胞被包裹在纖維組織中，細胞膜被強大的保護結(jié)構(gòu)包圍。溶菌酶（Lysozyme）、變?nèi)芫兀∕utanolysin）、MetaPolyzyme六種酶混合物、溶菌酶和鏈霉蛋白酶（Pronase）等細胞溶解酶或混合物可與組織消化酶（即膠原酶、軟骨素酶、透明質(zhì)酸酶）結(jié)合使用，用于溶解或破壞僅通過機械方法無法輕易裂解的結(jié)構(gòu)，例如細胞壁、殼、膠囊、衣殼等。酶促裂解后，均質(zhì)化、超聲處理或劇烈渦旋通常在裂解緩沖液中進行。
此外，由于細胞破碎會釋放內(nèi)源性蛋白酶和磷酸酶并降解靶蛋白，因此應保護樣品在細胞破碎和隨后使用蛋白酶和磷酸酶抑制劑純化期間不會失控地丟失靶蛋白。
