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熒光染料（簡介，原理）
Release Time：2022-02-05熒光染料或熒光染料使用的研究人員能夠通過熒光顯微鏡觀察特定的生物分子，通常熒光染料與靶分子（例如抗體）結(jié)合，熒光染料用于免疫組織化學(xué)和流式細胞術(shù)等技術(shù)。
熒光染料的介紹：
熒光染料，也稱為活性染料或熒光團，已被生物學(xué)家使用了數(shù)十年。 與熒光蛋白相比，熒光染料提供更高的光穩(wěn)定性和亮度，并且不需要成熟時間。 然而，熒光染料通常通過抗體偶聯(lián)物或肽標(biāo)簽靶向感興趣的蛋白質(zhì)。 這需要固定細胞，這使得遺傳電路動力學(xué)的測量變得不可能。 幾種熒光染料可用于活細胞，但在許多情況下，它們的適用性仍然有限。
熒光染料的原理：
熒光染料 的一個基本原理是在熒光劑的幫助下對細胞成分進行高度特異性的可視化。這可以是一種熒光蛋白——例如 GFP——在基因上與感興趣的蛋白質(zhì)相關(guān)聯(lián)。如果克隆是不可能的——例如在組織學(xué)樣本中——使用免疫熒光染色等技術(shù)來可視化感興趣的蛋白質(zhì)。為此，使用與不同熒光染料連接并直接或間接與適當(dāng)目標(biāo)結(jié)構(gòu)結(jié)合的抗體。在熒光染料的幫助下，熒光顯微鏡不僅限于蛋白質(zhì)，還可用于檢測核酸、聚糖和其他結(jié)構(gòu)。您甚至可以使用特定應(yīng)用的各種活細胞染料，這些染料允許使用細胞器選擇性染色（例如 ER、線粒體、高爾基體）或功能測定（例如，例如活細胞追蹤、標(biāo)記、細胞增殖或活死細胞測定，其中熒光是讀出方式。甚至可以檢測到鈣離子等非生物物質(zhì)。本文介紹了常用的熒光劑。
在熒光顯示過程中，有兩種方法可以顯示您感興趣的蛋白質(zhì)。要么借助內(nèi)在熒光信號——通過將熒光蛋白與靶蛋白進行基因連接——要么借助與目標(biāo)蛋白特異性結(jié)合的熒光標(biāo)記抗體。對于一些生物學(xué)問題，執(zhí)行后一個問題更有用甚至是必要的。例如，在組織學(xué)樣本的情況下，不可能使用熒光蛋白，因為通常樣本來自不含有任何熒光蛋白的生物體。此外，如果有功能性抗體可用，免疫熒光比熒光蛋白技術(shù)快得多，在熒光蛋白技術(shù)中，您必須克隆感興趣的基因并將 DNA 轉(zhuǎn)染到足夠的細胞中。熒光蛋白的另一個缺點在于它們本身就是蛋白質(zhì)的性質(zhì)。有了它，它們在細胞內(nèi)具有特定的蛋白質(zhì)特征，這可能導(dǎo)致功能障礙或?qū)λ街母信d趣蛋白質(zhì)的誤解。然而，應(yīng)該考慮使用熒光蛋白通常是研究活細胞的首選方法。
免疫熒光利用抗體對其抗原的非常特異性的結(jié)合親和力。這可以有兩種不同的外觀。最簡單的方法是使用一種與感興趣的蛋白質(zhì)結(jié)合的熒光標(biāo)記抗體。這稱為直接免疫熒光。
在大多數(shù)情況下，使用兩種形式的抗體。第一個與目標(biāo)蛋白結(jié)合，本身沒有熒光標(biāo)記（一抗）。但是與一抗結(jié)合的第二種抗體（二抗）特異性地攜帶熒光染料。這種方法稱為間接免疫熒光，具有幾個優(yōu)點。一方面存在放大效應(yīng)，因為不止一種二抗與一種一抗結(jié)合。另一方面，通常比用普通熒光染料標(biāo)記的特異性一抗更容易找到二抗。下面，我們回顧一下最常用的熒光染料。
DNA染色
您可能想使用熒光染料研究核酸。例如，通過檢測細胞核來定義細胞的確切位置或數(shù)量。最常見的 DNA 染色劑之一是 DAPI（4',6-diamidino-2-phenylindole），它與 DNA 雙螺旋的富含 A-T 的區(qū)域結(jié)合。與未結(jié)合狀態(tài)相比，如果連接到 DNA 上，DAPI 熒光強度會增加。它被最大波長為 358 nm 的紫外光激發(fā)。發(fā)射光譜很寬，峰值在 461 nm。對于 RNA 結(jié)合，也可以檢測到微弱的熒光。在這種情況下，發(fā)射移至 500 nm。有趣的是，DAPI 能夠滲透完整的質(zhì)膜，使其對固定細胞和活細胞有用。
第二種廣泛使用的 DNA 染色選項是 Hoechst 染料系列。 Hoechst 33258、Hoechst 33342 和 Hoechst 34580 是具有向 A-T 富集區(qū)域插入趨勢的雙苯并亞胺。與 DAPI 類似，它們被紫外光激發(fā)并在 455 nm 處具有最大發(fā)射，在未結(jié)合條件下移動到 510–540 nm。 Hoechst 染料還具有細胞滲透性，因此可用于固定細胞和活細胞。它們的毒性低于 DAPI。
不透膜的 DNA 染色劑是碘化丙啶，通常用于區(qū)分細胞培養(yǎng)物中的活細胞和死細胞，因為它不能進入完整細胞。碘化丙啶 也是一種嵌入劑，但對不同的堿基沒有結(jié)合偏好。在核酸結(jié)合狀態(tài)下，其最大激發(fā)波長為 538 nm。最高發(fā)射波長為 617 nm。未結(jié)合的碘化丙啶激發(fā)和發(fā)射最大值移動到較低的波長和較低的強度。它還可以在不改變其熒光特性的情況下與 RNA 結(jié)合。為了區(qū)分 DNA 和 RNA，有必要使用足夠的核酸酶。
一種無需事先操作即可在 DNA 和 RNA 之間產(chǎn)生差異的染料是 吖啶橙。它的最大激發(fā)/發(fā)射對在 DNA 結(jié)合狀態(tài)下為 502 nm/525 nm，在 RNA 結(jié)合狀態(tài)下變?yōu)?460 nm/650 nm。此外，它可以進入酸性區(qū)室，如陽離子染料質(zhì)子化的溶酶體。在這種酸性環(huán)境中，吖啶橙 被藍色光譜中的光激發(fā)，而橙色區(qū)域的發(fā)射最強。它通常用于識別凋亡細胞，因為它們有很多被吞噬的酸性隔間
熒光染料的介紹：
熒光染料，也稱為活性染料或熒光團，已被生物學(xué)家使用了數(shù)十年。 與熒光蛋白相比，熒光染料提供更高的光穩(wěn)定性和亮度，并且不需要成熟時間。 然而，熒光染料通常通過抗體偶聯(lián)物或肽標(biāo)簽靶向感興趣的蛋白質(zhì)。 這需要固定細胞，這使得遺傳電路動力學(xué)的測量變得不可能。 幾種熒光染料可用于活細胞，但在許多情況下，它們的適用性仍然有限。
熒光染料的原理：
熒光染料 的一個基本原理是在熒光劑的幫助下對細胞成分進行高度特異性的可視化。這可以是一種熒光蛋白——例如 GFP——在基因上與感興趣的蛋白質(zhì)相關(guān)聯(lián)。如果克隆是不可能的——例如在組織學(xué)樣本中——使用免疫熒光染色等技術(shù)來可視化感興趣的蛋白質(zhì)。為此，使用與不同熒光染料連接并直接或間接與適當(dāng)目標(biāo)結(jié)構(gòu)結(jié)合的抗體。在熒光染料的幫助下，熒光顯微鏡不僅限于蛋白質(zhì)，還可用于檢測核酸、聚糖和其他結(jié)構(gòu)。您甚至可以使用特定應(yīng)用的各種活細胞染料，這些染料允許使用細胞器選擇性染色（例如 ER、線粒體、高爾基體）或功能測定（例如，例如活細胞追蹤、標(biāo)記、細胞增殖或活死細胞測定，其中熒光是讀出方式。甚至可以檢測到鈣離子等非生物物質(zhì)。本文介紹了常用的熒光劑。
在熒光顯示過程中，有兩種方法可以顯示您感興趣的蛋白質(zhì)。要么借助內(nèi)在熒光信號——通過將熒光蛋白與靶蛋白進行基因連接——要么借助與目標(biāo)蛋白特異性結(jié)合的熒光標(biāo)記抗體。對于一些生物學(xué)問題，執(zhí)行后一個問題更有用甚至是必要的。例如，在組織學(xué)樣本的情況下，不可能使用熒光蛋白，因為通常樣本來自不含有任何熒光蛋白的生物體。此外，如果有功能性抗體可用，免疫熒光比熒光蛋白技術(shù)快得多，在熒光蛋白技術(shù)中，您必須克隆感興趣的基因并將 DNA 轉(zhuǎn)染到足夠的細胞中。熒光蛋白的另一個缺點在于它們本身就是蛋白質(zhì)的性質(zhì)。有了它，它們在細胞內(nèi)具有特定的蛋白質(zhì)特征，這可能導(dǎo)致功能障礙或?qū)λ街母信d趣蛋白質(zhì)的誤解。然而，應(yīng)該考慮使用熒光蛋白通常是研究活細胞的首選方法。
免疫熒光利用抗體對其抗原的非常特異性的結(jié)合親和力。這可以有兩種不同的外觀。最簡單的方法是使用一種與感興趣的蛋白質(zhì)結(jié)合的熒光標(biāo)記抗體。這稱為直接免疫熒光。
在大多數(shù)情況下，使用兩種形式的抗體。第一個與目標(biāo)蛋白結(jié)合，本身沒有熒光標(biāo)記（一抗）。但是與一抗結(jié)合的第二種抗體（二抗）特異性地攜帶熒光染料。這種方法稱為間接免疫熒光，具有幾個優(yōu)點。一方面存在放大效應(yīng)，因為不止一種二抗與一種一抗結(jié)合。另一方面，通常比用普通熒光染料標(biāo)記的特異性一抗更容易找到二抗。下面，我們回顧一下最常用的熒光染料。
DNA染色
您可能想使用熒光染料研究核酸。例如，通過檢測細胞核來定義細胞的確切位置或數(shù)量。最常見的 DNA 染色劑之一是 DAPI（4',6-diamidino-2-phenylindole），它與 DNA 雙螺旋的富含 A-T 的區(qū)域結(jié)合。與未結(jié)合狀態(tài)相比，如果連接到 DNA 上，DAPI 熒光強度會增加。它被最大波長為 358 nm 的紫外光激發(fā)。發(fā)射光譜很寬，峰值在 461 nm。對于 RNA 結(jié)合，也可以檢測到微弱的熒光。在這種情況下，發(fā)射移至 500 nm。有趣的是，DAPI 能夠滲透完整的質(zhì)膜，使其對固定細胞和活細胞有用。
第二種廣泛使用的 DNA 染色選項是 Hoechst 染料系列。 Hoechst 33258、Hoechst 33342 和 Hoechst 34580 是具有向 A-T 富集區(qū)域插入趨勢的雙苯并亞胺。與 DAPI 類似，它們被紫外光激發(fā)并在 455 nm 處具有最大發(fā)射，在未結(jié)合條件下移動到 510–540 nm。 Hoechst 染料還具有細胞滲透性，因此可用于固定細胞和活細胞。它們的毒性低于 DAPI。
不透膜的 DNA 染色劑是碘化丙啶，通常用于區(qū)分細胞培養(yǎng)物中的活細胞和死細胞，因為它不能進入完整細胞。碘化丙啶 也是一種嵌入劑，但對不同的堿基沒有結(jié)合偏好。在核酸結(jié)合狀態(tài)下，其最大激發(fā)波長為 538 nm。最高發(fā)射波長為 617 nm。未結(jié)合的碘化丙啶激發(fā)和發(fā)射最大值移動到較低的波長和較低的強度。它還可以在不改變其熒光特性的情況下與 RNA 結(jié)合。為了區(qū)分 DNA 和 RNA，有必要使用足夠的核酸酶。
一種無需事先操作即可在 DNA 和 RNA 之間產(chǎn)生差異的染料是 吖啶橙。它的最大激發(fā)/發(fā)射對在 DNA 結(jié)合狀態(tài)下為 502 nm/525 nm，在 RNA 結(jié)合狀態(tài)下變?yōu)?460 nm/650 nm。此外，它可以進入酸性區(qū)室，如陽離子染料質(zhì)子化的溶酶體。在這種酸性環(huán)境中，吖啶橙 被藍色光譜中的光激發(fā)，而橙色區(qū)域的發(fā)射最強。它通常用于識別凋亡細胞，因為它們有很多被吞噬的酸性隔間
